Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ТИПИЧНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СМЕСЬ

Анализируемая ДНК. Это может быть как отдельный кусочек молекулы, так и плазмида, хромосома или геном клетки полностью. Для грубой оценки сойдет даже суспензия клеток. ДНК служит матрицей для многократного копирования нужного участка.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Праймеры — это искусственно синтезированные короткие цепочки нуклеотидов (15–30 штук), комплементарные выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК. Один из праймеров обычно соответствует началу амплифицируемого отрезка, другой — его концу, но на противоположной цепи. У праймеров есть 3ˊ- и 5ˊ-концы.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Нуклеотиды. Четыре вида дезоксинуклеотидтрифосфатов, необходимых для строительства цепей ДНК: — АТФ, ТТФ, ЦТФ и ГТФ.

ДНК-полимераза – фермент, строящий комплементарную матричной цепь ДНК. Он может начинать синтез только от 3ˊ-конца праймера. Обычно используют термостабильные полимеразы, изначально выделенные из термофильных бактерий и архей: Thermus

aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза) и Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза). Первая — самая производительная, а две другие — более точные.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Буфер – раствор, содержащий различные ионы для поддержания нужного рН, соли магния, необходимые для работы полимеразы, и неионный детергент Tween-20 в сочетании с BSA (бычьим сывороточным альбумином) для предотвращения налипания

компонентов реакции на стенки пробирки. В случае ГЦ-богатых матриц в смесь часто добавляют энхансер — ДМСО (диметилсульфоксид), предотвращающий нежелательные взаимодействия между комплементарными участками матрицы.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2. Отжиг (гибридизация ДНК с праймерами): когда цепи разошлись температуру снижают до 30-35°С, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей происходит образование двунитиевого участка ДНК в строго специфичных областях комплементарных праймеров. Время стадии отжига — 30 секунд, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

3. Элонгации комплементарной мРНК: при температуре 60-70°С начинается синтез ДНК-полимеразой дочерней цепи ДНК с двунитиевого участка образованного праймерами. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 минут.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

При каждом цикле происходит двукратное увеличение числа синтезированных копий, выбранных для амплификации участка ДНК.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Чтобы увидеть, намножились ли нужные участки ДНК, после окончания ПЦР содержимое пробирок подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле с последующим окрашиванием — так молекулы ДНК разной длины разделяются пространственно и становятся видны невооруженным глазом.