Секвенирование нуклеиновых кислот
Такой метод значительно производительнее, позволяя одновременно считывать миллионы коротких фрагментов. Это привело к возможности определения последовательности сразу десятков
геномов (в зависимости от их размера) за один запуск прибора.
Размер одного прочитанного фрагмента при таком методе варьирует от 25 до 500.
Секвенирование нуклеиновых кислот
Пиросеквенирование – один из методов глубокого секвенирования, предложенным на суд научного сообщества, было пиросеквенирование, подразумевающее «секвенирование путем синтеза». Основной смысл этого типа секвенирования заключается в последовательном синтезе ДНК на ДНК-фрагментах изучаемого организма в специальных пиколитровых «реакторах». В ходе синтеза дочерней цепочки ДНК детектируют пирофосфаты, высвобождающиеся при включении нуклеотида в синтезируемую на матрице комплементарную цепь.
Секвенирование нуклеиновых кислот
Быстрота и дешевизна методов NGS, недоступная ранее, спровоцировала бум в индустрии геномных исследований. Благодаря NGS появилась возможность делать ранее технически недоступные эксперименты. Применение NGS не ограничивается определением геномных последовательностей, а распространяется до изучения траскпритома, структуры хроматина и других областей молекулярной и клеточной биологии. Ниже представлены основные примеры направлений применения методов NGS.
Секвенирование нуклеиновых кислот
Все современные секвенирующие платформы отличаются от метода секвенирования по Сэнгеру тем, что не требуют этапа клонирования фрагментов ДНК. Это экономит рабочее время и позволяет избежать ряда проблем с клонированием АТ-богатых участков. Общий принцип пробоподготовки для большинства современных (NGS) секвенаторов включает фрагментирование ДНК, привязку
к субстрату, амплификацию фрагментов с помощью ПЦР (в одномолекулярном секвенировании от ПЦР удалось отказаться) и последующее считывании последовательности НК.
Секвенирование нуклеиновых кислот
Секвенирование РНК. Большинство экспериментов по секвенированию РНК проводятся на оборудовании, которое предназначено для секвенирования молекул ДНК. В связи с этим необходимым шагом для секвенирования РНК является создание библиотеки кДНК (комплементарной ДНК), полученной из исследуемой тотальной РНК.
Секвенирование нуклеиновых кислот
Перед секвенированием кДНК (комплементарной ДНК) ее необходимо амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции. Непосредственно перед проведением ПЦР можно ввести молекулярные маркеры. Эта процедура особенно актуальна, если РНК в образце изначально немного, как, например, в случае секвенирования РНК одной клетки.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) – метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в биологическом материале (пробе).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК- полимеразы (репликация ДНК). Метод позволяет добиться колоссального (до 10 в 12 степени раз) увеличения или амплификации числа копий определенного фрагмента ДНК.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий;
1)денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);
2)образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);
3)синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Стадии ПЦР:
1. Денатурация.
Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C на 0,5—2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (денатурацией), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.