Секвенирование нуклеиновых кислот
Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот) — определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В результате секвенирования
получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру.
Секвенирование нуклеиновых кислот
МЕТОДЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НК
Метод Максама и Гилберта (химический).
Один из методов основан на химической деградации ДНК.
Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. Разрушение идет в 2 этапа.
Секвенирование нуклеиновых кислот
На первом этапе происходит модификация азотистого основания и последующее выщепление его. На втором этапе производят гидролиз ДНК в местах выщепления оснований. Пуриновые основания модифицируются диметилсульфатом.
В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы.
Секвенирование нуклеиновых кислот
Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках, после этого с помощью блоттинга переводят содержимое электрофорезного геля на нитроцеллюлозу, закрепляют и затем проводят радиоавтографию. Те фрагменты, которые содержат радиоактивную метку, оставляют «отпечатки» на рентгеновской пленке. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание - его положение.
Так набор полос на рентгеновской пленке определяет нуклеотидную последовательность ДНК.
Секвенирование нуклеиновых кислот
Секвенирование нуклеиновых кислот
Метод Сэнгера («классический», ферментативный).
Метод секвенирования НК путем "обрыва цепи" основан на синтезе новой ДНК-цепи на анализируемой ДНК-матрице с участием ДНК- полимеразы в присутствии праймера и смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов и на случайном обрыве синтезируемой цепи при встраивании одного из меченных разными флуоресцентными красителями дидезоксинуклеотидов.
Секвенирование нуклеиновых кислот
Метод Сэнгера позволяет «считывать» последовательности до 1000 пар оснований и используется для небольших фрагментов генома/генов или для валидации результатов более современного секвенирования нового поколения (next-generation sequencing, NGS).
Секвенирование нуклеиновых кислот
Метод Сэнгера используется для:
•секвенирования отдельных участков генома с целью анализа мутаций и полиморфизмов;
•идентификации вирусов и организмов (бактерий, растений, грибов и животных);
•валидации данных, полученных на платформах секвенирования нового поколения (NGS);
•микросателлитного анализа;
•анализа делеций и инсерций (малых и протяженных).
Секвенирование нуклеиновых кислот
Актуальность этого типа определения последовательности НК сохраняется из-за высокой точности (достоверности) полученных данных и невысокой стоимости работ при анализе небольшого количества ДНК-фрагментов.
Секвенирование нуклеиновых кислот
Методы NGS (методы нового поколения) используют для глубокого (многократного) прочтения генетического материала, которое необходимо, например, для ресеквенирования (повторное определение последовательности ДНК организма с уже расшифрованным геномом) и сборки новых геномов (de novo), транскриптомных и эпигеномных исследований.