Лабораторная работа 3-2

КМ К-562 метят изотопом ³Н-уридином (1 мкКи/мл) и инкубируют 1 ч при 37 °С. Затем клетки трижды отмывают культуральной средой, содержащей 10% СЭК. Отмытые КМ выдерживают в культуральной среде 2 ч при 37 °С и отмывают еще раз с целью удаления ³Н-уридина, не включившегося в РНК КМ. Готовят рабочую суспензию меченых КМ с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 1×10⁶ КМ и 5 мкг панкреатической РНК-азы.

Цитотоксическую реакцию проводят в круглодонных 96-луночных микропланшетах. В каждую ячейку помещают по 100 мкл рабочей суспензии меченых КМ с РНК-азой и 100 мкл суспензии мононуклеарных клеток (рабочая концентрация - 1х10⁷/мл). Используют различные соотношения КЭ:КМ - 100:1; 50:1; 25:1; 12,5:1. Клетки каждого разведения помещают как минимум в 3 лунки. В контрольных пробах меченые КМ инкубируют без мононуклеарных клеток.

Культуры инкубируют 14 ч при 37 °С и с 5% содержанием СО₂. После инкубации содержимое лунок переносят на фильтры с помощью собирателя клеток - харвестра. Фильтры высушивают, помещают в сцинтилляционную жидкость, проводят учет реакции с помощью β-счетчика. Показатель функциональной активности естественных киллеров выражают в виде индекса цитотоксичности (ИЦ), который определяют по формуле:

Оценка функциональной активности nk-клеток с использованием проточной цитометрии

В качестве метки для КМ применяют флуоресцентный краситель 5-, 6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир (КФДЭ), который образует прочную ковалентную связь с внутриклеточными белками и в используемой концентрации не влияет на жизнеспособность клетки.

Первоначально нефлуоресцирующий КФДЭ проникает через клеточную мембрану. Карбоксифлуоресцеины связываются с внутриклеточными молекулами, формируя конъюгаты, обеспечивая стойкое флуоресцентное окрашивание клетки. Окрашенные таким образом КМ К-562 смешивают с КЭ и инкубируют в течение нескольких часов. После окончания культивирования клетки окрашивают пропидий йодидом для определения убитых в ходе реакции КМ. По количеству убитых К-562 определяют активность NK-клеток. Анализ проводят на проточном цитофлуориметре и определяют количество КМ, включивших КФДЭ (зеленое свечение), и количество убитых клеток, включивших пропидий йодид (красное свечение).

Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность

In vivo случается чаще всего в патологических условиях и направлена на безъядерные клетки - эритроциты и тромбоциты, реже на ядросодержащие клетки крови, например нейтрофилы. Проявляются эти процессы в форме гемолитических анемий, тромбоцитопений, нейтропений. Этиология, как правило, либо инфекционная, либо лекарственная.

Комплементзависимая цитотоксичность

Микролимфоцитотоксический тест. Этот вариант иммунной цитотоксичности используют в качестве лабораторного теста в трансплантологии для оценки возможного наличия в крови реципиента антител к клеточным антигенам предполагаемого донора.

Тест проводят следующим образом.

1. У реципиента берут периферическую кровь, получают сыворотку и раскапывают, например, двукратные разведения этой сыворотки в лунки планшета.

2. У донора берут периферическую кровь, выделяют из нее лейкоциты или фракцию мононуклеаров (что лучше) и аликвоты клеток, например по 2×10⁵ на лунку, раскапывают в лунки с разведениями сыворотки реципиента.

3. Планшеты инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37 °С в течение 45-60 мин.

4. Затем в лунки добавляют комплемент (заранее оттитрованную сыворотку кролика или морской свинки).

5. Продолжают инкубацию еще 30-45 мин.

6. Поврежденные клетки выявляют по включению суправитального красителя - трипанового синего, для чего из каждой лунки берут аликвоту клеток, добавляют к этой аликвоте 0,5% раствор трипанового синего и в камере Горяева подсчитывают число прокрашенных (поврежденных) и непрокрашенных (живых) клеток.

В случае если процент поврежденных клеток достоверно превышает таковой в контроле (т.е. в лунках, в которые не вносили сыворотку реципиента), то данный донор получает отвод.

После внедрения в клиническую практику трансплантологии этого теста трансплантологи значительно реже сталкиваются со случаями сверхострого отторжения трансплантатов.

В другом варианте микролимфоцитотоксический тест применяют для серологического типирования HLA специфичностей. Основные этапы теста указаны на рис. 3.2 (см. также цв. вклейку). В качестве КМ используют выделенные из крови пациента мононуклеарные клетки серотипирования HLA специфичностей класса I или очищенную фракцию В-клеток, например на колонке со стеклянной ватой, для тестирования специфичностей HLA класса II. Клетки инкубируют с панелью стандартных типирующих сывороток и после добавлениия комплемента определяют количество убитых и выживших клеток.

Рис. 3.2. Микролимфоцитотоксический тест (серотипирование HLA класса I)