- •3.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов
- •3.2. Оценка клеточной цитотоксичности
- •Лабораторная работа 3-1
- •Оценка цитотоксической активности с использованием проточной цитометрии
- •Определение перфорина методом elispot
- •Связывание с тетрамерными структурами mhc класса I
- •Лабораторная работа 3-2
- •Оценка функциональной активности nk-клеток с использованием проточной цитометрии
- •3.3. Оценка функциональной активности
- •Фагоцитов
- •Метод оценки хемотаксиса нейтрофилов с использованием камеры Бойдена
- •Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro
- •Определение выработки активных форм кислорода и оксида азота
- •Описание метода люминолзависимой хемилюминесценции
- •Определение содержания no в супернатантах культуры фагоцитов in vitro
- •Постановка реакции выявления аок (метод н. Йерне)
- •Непосредственная постановка реакции
- •Метод колониеобразования кроветворных клеток в селезенке облученных мышей
- •Вопросы и задания
3.2. Оценка клеточной цитотоксичности
Классический феномен цитотоксичности - способность Т-лимфоцитов распознавать клеточные элементы, несущие признаки генетической чужеродности (в частности, клетки, модифицированные вирусом, опухолевые клетки, аллогенные и ксеногенные клетки), и уничтожать их. NK-клетки, в отличие от Т-лимфоцитов, распознают как чужеродные клетки организма, утратившие антигены главного комплекса гистосовместимости (молекулы МНС). Другие клетки (например, В-лимфоциты, моноцитарно-макрофагальные клетки, эозинофилы, нейтрофилы и т.п.) также способны к цитотоксичности, но эта функция связана с привлечением антител против клетки-мишени - КМ (антителозависимая клеточная цитотоксичность), цитокинов (ФНОа) и иных агентов. В физиологических условиях, т.е. в норме, цитотоксичность клеток иммунной системы направлена на разрушение и элиминацию стареющих и поврежденных клеток, таким образом обеспечивая клиренс многоклеточного организма от отживших клеток и продуктов их распада.
|
Основные клетки, обладающие цитотоксичностью, - антигенспецифические цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ), NK (естественные киллеры), а также клетки миелоидного ряда (макрофаги, нейтрофилы).
Цитотоксическая активность клеток-киллеров реализуется при непосредственном синаптическом контакте лимфоцита (клеткиэффектора - КЭ) с КМ. При этом в КМ индуцируется апоптоз.
В зрелом дифференцированном цитотоксическом лимфоците формируются гранулы, содержащие перфорин и гранзимы. После образования синапса между КЭ и КМ гранулы концентрируются в области контакта и затем освобождаются в направлении КМ. Перфорин при контакте с мембраной КМ полимеризуется и встраивается в мембрану, формируя в ней пору диаметром около 100 Ǻ. В эту пору проникают гранзимы - ферменты, инициирующие апоптоз КМ.
Индукция апоптоза в КМ также может происходить через CD95 молекулы (другое название Fas), содержащие домен смерти. Лигандом CD95 служит молекула FasL (CD178), экспрессируемая на ЦТЛ, NK-клетках. В некоторых случаях КЭ сами становятся «жертвой» Fas-опосредованного апоптоза. Экспрессируя Fas-молекулы,
они могут проконтактировать с клетками, несущими Fas-лиганд, например, при потытке преодолеть гематоэнцефалический барьер. Повышенная экспрессия Fas (CD95) молекул на активированных лимфоцитах демонстрирует их способность к апоптозу при несостоявшихся физиологических процессах пролиферации и дифференцировки после активации. Считается, что такой процесс может привести к феномену, обозначенному как иммунодефицит, вызванный активацией (Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н.).
В системе in vitro степень разрушения КМ приближается к лизису. Методов оценки функциональной активности ЦТЛ существует несколько, однако «золотым стандартом» до сих пор считается «хромовый тест». Под «хромом» имеют в виду соль хромата натрия, содержащую радиоактивный изотоп хрома - Na251CrO4, которую используют для мечения КМ. Такую метку подобрали опытным путем как относительно удовлетворяющую следующим критериям: свободно проникать в живые клетки и не выходить оттуда, пока клетка жива. Метка не вступает в прочные соединения с внутриклеточными структурами и имеет возможность выйти во внеклеточную среду из погибающей КМ.
|
Выбор КМ - отдельная творческая задача, которую экспериментально решают в соответствии с целями конкретного исследования. Чаще всего в качестве КМ используют опухолевые или зараженные вирусом клетки. Когда КМ выбраны, дальнейшая схема эксперимента кратко представляет собой следующее.