Лабораторная работа 3-1
1. 1х106 КМ инкубируют в среде, содержащей изотоп Na251CrO4 (37×105 Bq или 100 мкКю, специфическая активность 5 мкКю/моль), при 37 °С в течение 1-1,5 ч, после чего тщательно отмывают от не вошедшего в клетки изотопа.
2. КМ подсчитывают и раскапывают в подобранной дозе в лунки культуральных круглодонных микропланшетов.
3. В те же лунки вносят КЭ. Соотношение КМ и КЭ обычно составляет от 1:10 до 1:500 в пользу КЭ.
4. Плашки подвергают мягкому центрифугированию - 150 g в течение 1 мин, после чего помещают в СО2-инкубатор при 37 °С на 4-6 ч.
5. По завершении культивирования плашки центрифугируют при 250 g в течение 5 мин для плотного осаждения клеток.
6. Супернатанты собирают в специальные пробирки, в которых радиоактивность подсчитывают в γ-счетчике.
7. В качестве контроля используют:
а) лунки с КМ, в которые не вносят КЭ, - это контроль спонтанного выхода метки;
б) лунки с КМ, в которые вместо КЭ вносят детергент Triton X-100 1% (v/v), - это контроль максимально возможного высвобождения метки из КМ.
Цитотоксичность в опытных лунках рассчитывают обычно по следующей формуле:
где
CPM - это число импульсов в минуту
соответственно в экспериментальных
лунках (СРМn),
в лунках со спонтанным высвобождением
метки (СРМспонтанно)
и в лунках с максимально возможным
высвобождением метки (CPMmax).
Оценка цитотоксической активности с использованием проточной цитометрии
Кроме описанного «хромового» теста, существуют методики оценки клеточной цитотоксичности с использованием проточного цитофлуориметра. В данном случае для мечения клеток используют два реагента. Сначала метят КМ флуорохромом, который проникает в клетки, не повреждая их, и флуоресцирует, возбужденный лазерным излучением. Затем к КМ добавляют КЭ, инкубируют их совместно, чтобы дать возможность реализоваться киллерной атаке, и добавляют к смеси второй реагент, превращающийся во флуорохром только в живых клетках под действием их ферментов-эстераз. В результате в итоговой картине КЭ станут светиться одним цветом «живого флуорохрома», живые КМ будут двухцветными, погибшие КМ - одноцветными по первому флуорохрому.
|
Известен метод оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности с использованием в качестве КМ эритроцитов (например, барана), покрытых IgG- антителами к ним. КЭ, несущие Fc-рецепторы к IgG, разрушают (лизируют) КМ, и по уровню освобождаемого в культуральную среду гемоглобина судят об активности таких киллеров (NK, В-клетки, моноциты, макрофаги и др.).
Определение перфорина методом elispot
Белок перфорин является необходимым компонентом лизиса, осуществляемого ЦТЛ и NK-клетками для уничтожения КМ. Метод ELISPOT (см. гл. 4) широко применяется для определения выработки цитокинов антигенспецифическими Т-клетками. Метод ELISPOT достаточно чувствителен для выявления перфорина после активации ЦТЛ соответствующими антигенными эпитопами, например вирусными (потенциально годен для использования любой эпитоп). При выполнении данного метода на дне лунки пластикового планшета фиксируются монАТ к перфорину. Недостаток метода - отсутствие возможности определить фенотип клеток, секретирующей перфорин, что частично компенсируется обогащением фракции ЦТЛ магнитной сепарацией. В экспериментах с использованием иммуномагнитной сепарации показано: основную популяцию клеток, образующих «пятна», составляют CD8+
Т-лимфоциты (80-90%).