- •3.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов
- •3.2. Оценка клеточной цитотоксичности
- •Лабораторная работа 3-1
- •Оценка цитотоксической активности с использованием проточной цитометрии
- •Определение перфорина методом elispot
- •Связывание с тетрамерными структурами mhc класса I
- •Лабораторная работа 3-2
- •Оценка функциональной активности nk-клеток с использованием проточной цитометрии
- •3.3. Оценка функциональной активности
- •Фагоцитов
- •Метод оценки хемотаксиса нейтрофилов с использованием камеры Бойдена
- •Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro
- •Определение выработки активных форм кислорода и оксида азота
- •Описание метода люминолзависимой хемилюминесценции
- •Определение содержания no в супернатантах культуры фагоцитов in vitro
- •Постановка реакции выявления аок (метод н. Йерне)
- •Непосредственная постановка реакции
- •Метод колониеобразования кроветворных клеток в селезенке облученных мышей
- •Вопросы и задания
Связывание с тетрамерными структурами mhc класса I
Конструирование тетрамерных комплексов MHC класса I обеспечило создание быстрого, специфичного и высокочувствительного метода выявления и подсчета антигенспецифических CD8+ Т-клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. Тетрамер состоит из молекул MHC класса I, нагруженных специфическим антигенным пептидом, связанных с биотином, которые затем прикрепляются к стрептавидину, меченному флуорохромом - ФИТЦ, ФЭ и др. (рис. 3.1, см. также цв. вклейку). Тетрамеры MHC класса I связываются с CD8+ субпопуляцией Т-лимфоцитов. Созданы тетрамеры MHC класса II, связывающиеся с CD4+ Т-лимфоцитами. Тетрамерные структуры характеризуются сниженной способностью связывания с молекулой CD8. Однако сохраняют способность специфически связываться с TКР, обеспечивая точное узнавание антигенспецифических Т-клеток. Количество выявляемых данным методом антигенспецифических клеток составляет менее 1% от всех CD8+-клеток.
|
Отдельное использование тетрамерного связывания не дает информации о фенотипе клеток или функции ЦТЛ, поэтому целесообразно параллельно проводить определение внутриклеточного содержания цитокинов, хемокинов и цитотоксических эффекторных молекул (перфорина, гранзимов), фенотипа специфических CD8+ Т-лимфоцитов.
Рис. 3.1. Тетрамерные структуры: а - строение тетрамерной структуры; б - связывание тетрамера ЦТЛ; в - пример результатов, полученных при анализе тетрамерных структур на проточном цитофлуориметре; ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоционат; ФЭ - фикоэритрин
Использование методов цитофлуориметрического определения цитотоксической активности в комбинации с тетрамерным методом и иммунофенотипированием позволяет полно охарактеризовать популяции КЭ (ЦТЛ) и КМ. Данные методы - мощный инструмент для изучения кинетики киллерной активности ЦТЛ, они дают представление о фенотипе клеток и позволяют отслеживать физиологические изменения в КЭ и КМ
Определение каспаз методом проточной цитофлуорометрии
В результате запуска апоптоза, опосредованного перфорин/гран- зимовым и Fas/FasL механизмами, в КМ активируются каспазы. Данным методом определяют внутриклеточную активацию каспаз в КМ, используя белки, содержащие меченные флуорофором участки, подверженные расщеплению каспазами. Нерасщепленный флуорофор образует «молчащий» димер, после расщепления каспазами мономеры флуоресцируют.
Определение цитотоксической активности NK-клеток
NK составляют около 10-15% лимфоцитов периферической крови человека. NK - клетки врожденного иммунитета, в них не происходит перегруппировки генов I-клеточного рецептора (ТКР), кодирующих антигенраспознающие рецепторы. Функция NK - распознавание и уничтожение в организме клеток, пораженных вирусом, опухолевых клеток, лишенных МНС хозяина. NK проявляют функциональную активность без предварительной сенсибилизации и обладают так называемой естественной цитотоксичностью. Кроме того, NK способны уничтожать КМ, покрытые IgG антителами, вовлекая рецептор для IgG - FcγRIII (CD16). Такой тип цитотоксичности получил название антителозависимой клеточной цитотоксичности.
|
Функциональная активность NK оценивается по способности убивать КМ (например, клетки эритромиелоидной линии К562 человека, меченные радиоактивными изотопами 51Cr или 3Н-уридином).