10. Рнк: строение, классификация, функции

Полимеры с рибонуклеозидами: аденонин, гуанозин, цитидин, уридин. 3'-5' связи. В отличие от ДНК не только в ядре, но и в цитозоле, рибосомах. Одноцепочечные, но есть дуплексы (двухцепочечные участки), образующие шпильки (комплементарность); в шпильках РНК антипараллельны.

2 класса: кодирующая белки мРНК и не кодирующие белки РНК (тРНК и рРНК), обслуживающие процесс синтеза белка, + митохондриальная РНК (свой генетический и белково-синтетический аппарат)

мРНК: синтезируется в ядре, последовательность (матрица) для синтеза белка, закодированного в гене. На 3'-конце 100-200 аденозинфосфатных остатов (поли(А)-фрагмент), на 5'-конце модифицированный нуклеотид 7-метилгуанозин-5'-трифосфат (кэп). Через несколько десятков нуклеотидов от кэпа инициирующий кодон — триплет AUG (Met). За кодирующим участком терминирующий или стоп-кодон UGA, UUA, UAG.

т РНК: доставка АК к рибосоме при синтезе белка. "Клеверный лист". На 3'-конце участок C-C-A связывания АК, на противоположном — антикодон-триплет, комплементарный корону матричной РНК. Каждой АК соответствуют тРНК с триплетом-кодоном, благодаря чему информация реализуется однозначно. В состав тРНК входят минорные основания (10-12 на молекулу) — метилированные основания, изомеры, аналоги пиримидинов; делают молекулу устойчивой к расщеплению нуклеазами и обеспечивают пространственную структуру, так как комплементарных пар не образуют и препятствуют спирализации молекулы на участках.

рРНК: в рибосомах, до 60% массы. Рибосомы обеспечивают трансляцию. У рРНК много удвоенных спирализованных участков, встречаются минорные основания и производные рибозы.

+ малые интерференционные РНК (миРНК, siRNA) и другие короткоцепочечные РНК, циркулирующие в крови: регуляция процессов репликации ДНК, транскрипции, трансляции.

11. Полимеразная цепная реакция

ПЦР — метод амплификации (накопления) нужных небольших фрагментов ДНК. Нужно для идентификации, нахождения ДНК вирусов или бактерий.

Исходные компоненты: ДНК-матрица, праймеры, дезоксинуклеотидтрифосфаты, ДНК-полимераза. Контроль с помощью температуры.

ДНК-полимераза 1 двигается по одноцепочечной молекуле ДНК, катализирует образование фосфодиэфирных связей между 3' гидроксилом предыдущего нуклеозида и 5' фосфатной группой следующего, то есть рост новой цепи от 5' к 3'. В качестве стройматериала 5' нуклеозидтрифосфаты. Скорость велика, у прокариот 1000 оснований в секунду. Полученные цепи тоже распадаются и от них цикл повторяется.

1 этап: 95, денатурация ДНК.

2 этап: 50-65, отжиг праймеров к ДНК.

3 этап: 70-72, оптимально для полимеразы — достраивание цепей праймера (Taq-полимераза).

Открыл американец Артур Корнберг.

12. Определение первичной структуры нуклеиновых кислот. Методы химического (по Максаму-Гилберту) и ферментативного (по Сэнгеру) с еквенирования. Автоматизация секвенирования.

Секвенирование — определение последовательности.

ХИМИЧЕСКИЙ: прочтение коротких одноцепочечных олигонуклеотидов. Гидролиз олигонуклеотида и анализ фрагментов с помощью электрофореза.

1. Мечение олигонуклеотида введением радиоактивного остатка фосфорной кислоты по 5'-концу. Образец делят на 4 порции и в каждую пробирку разные реагенты.

2. Диметилсульфат расщепляет по гуаниновым звеньям — 4 фрагмента, но только 2 радиоактивно меченые (с радиоактивным фосфатом на 5'-конце)

3. Муравьиная кислота по пуриновым основаниям на 8 фрагментов, 4 радиоактивные.

4. Гидразин по пиримидиновым, радиоактивные 4.

5. Гидразин в присутствии NaCl только по цитидинам — 4 фрагмента, 2 радиоактивных.

6. 4 смеси наносят в лунки геля и проводят электрофорез, радиоактивные метки проявляют на фотобумаге.

7. Сборка молекулы с самого короткого фрагмента (самый большой пробег на картинке фореза).

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ: способность полимеразы синтезировать новую цепь нуклеотида, комплементарную материнской.

В пробирку: молекулу ДНК (матрица); 2 праймера — олигонуклеотиды длиной 20-25 оснований, комплементарные крайним участкам цепей ДНК, которые будут размножены; набор 5'-нуклеозидтрифосфатов; фермент Pol1. Праймеры нужны, потому что полимераза не работает с "пустого" места, она катализирует конденсацию между 3' гидроксилом предыдущего нуклеотида.

1. Денатурация ДНК

2. Понижение температуры, присоединение праймеров с 3' каждой цепи ("отжиг праймеров")

3. ДНК-полимераза синтезирует на каждой материнской цепи комплементарную дочернюю, удлиняя праймеры 5' → 3'. Полученные 2 двойные молекулы плавят, обжигают праймеры, затем они "прирастают" уже на 4 копиях. С каждым циклом в смеси кол-во копий увеличивается в 2ⁿ раз.

Полимераза в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, что для белков не характерно — спасибо термофильным бактериям с Taq-полимеразой, которая активна около 100 градусов.

С енгер разработал способ секвенирования ДНК на основе ПЦР: метод обрыва цепи или метод дидезокситерминаторов. Обрыв/терминация цепи происходит, когда в дочернюю цепь включается нуклеозидтрифосфат без 3'-гидроксильной группы — дидезоксирибонуклеозидтрифосфат.

1. Все необходимые компоненты ПЦР

2. Делят на 4 части и дополнительно вносят везде ДДНКТФ

3. Каждый раз, когда при синтезе цепи в цепь включается остаток, синтез останавливается (нет гидроксила), поэтому в пробирке накапливаются олигонуклеотиды разной длины и заканчивающиеся либо на аденозине, либо на цитидине, либо на гуанозине, либо на тимидине.

4. Смеси анализируют с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях. В зависимости от размера продукты ПЦР двигаются в геле с разной скоростью. Картинку проявляют радиоавтографией, для чего продукты метят изотопной меткой. Полученное изображение читают снизу-вверх по полоскам.

5. Итоговая последовательность комплементарна исходной матрице.

Автоматизация секвенирования: уже в автоматическом режиме, для анализа флуоресцентные метки, которые присоединяют к молекулам дидезокситрифосфатов. Каждая метка имеет свой спектр свечения. Для электрофореза используют капилляры с гелем. Свечение инициируется лазерным лучом и по цвету соотносится с основанием. Есть генный анализатор до 1000 нуклеотидов определяет, 16 образцов одновременно.