Immunology / Gankovskaia_L._Основы общен иммунологии

фоцитов, взаимодействующих с высоким аффинитетом с аутоантигенами. Этот механизм называется делецией аутоагрессивных клонов или селекцией В-лимфоцитов. В процессе селекции незрелые В-клетки (IgM+) взаимодействуют с помощью BCR с аутоантигенами (растворенными и связанными с поверхностью клеток). При отсутствии реакции В- лимфоцит продолжает нормальное развитие,

врезультате которого образуется функционально полноценный зрелый В-лимфоцит (IgM+IgD+), с высокой экспрессией мембранного IgM. В случае распознавания аутоантигена может происходить индукция анергии (т.е. утрата работоспособности клеток),

врезультате которой формируется зрелый В-лимфоцит с высокой экспрессией мембранного IgD. В некоторых случаях может происходить дополнительное редактирование V-ге- нов В-клеточного рецептора, если после этого аутореактивность не утрачивается, клетка подвергается апоптозу. Зрелые В-лимфоциты с полноценным антигенраспознающим BCR покидают костный мозг и мигрируют в периферические органы иммунной системы.

6.2.3. • •

•-

Как таковые В-лимфоциты не вырабатывают антител, но они являются предшественниками плазматических клеток, выполняющих эту функцию.

Зрелые В-лимфоциты мигрируют в периферические лимфоидные органы (лимфатические узлы, селезенку), где формируют первичные фолликулы. Здесь В-лимфоци- ты могут взаимодействовать с антигенами, попадающими сюда по путям лимфогенного и гематогенного распространения, либо

сфолликулярными дендритными клетками, представляющими на своей поверхности через Fc-рецепторы комплексы антиген–ан- титело. В-лимфоциты распознают антиген

спомощью специфического BCR. Затем BCR

сантигенной молекулой интернализируется, т.е. перемещается внутрь В-лимфоцита, подвергается процессингу, и антигенная детерминанта, встроенная в молекулу МНС II, транспортируется на клеточную мембрану. Для дальнейшей дифференцировки В-клеток необходимо взаимодействие с Т-хелперами.

Впролиферирующих центробластах происходит дополнительный процесс формирования разнообразия антител в результате соматической гипермутации в уже перестроенных V-генах иммуноглобулинов. Суть соматической гипермутации заключается в возникновении точечных мутаций в V-областях генов иммуноглобулинов (рис. 6.9). Благодаря этому процессу во время прохождения иммунного ответа аффинность BCR (соответственно, и антител, которые будут вырабатываться) к антигену, индуцировавшему иммунный ответ, может многократно возрастать, тем самым повышая эффективность иммунного ответа.

Финальной стадией дифференцировки В-лимфоцитов является плазматическая клетка. На мембране плазматической клетки не экспрессируются иммуноглобулиновые рецепторы, МНС II класса и другие молекулы, характерные для В-лимфо- цитов. Плазмоциты активно синтезируют и секретируют растворимую форму иммуноглобулинов — антитела. Помимо дифференцировки в плазматические клетки В-лимфоциты могут формировать пул долгоживущих В-клеток памяти.

BCR

, BCR (Ig)

Рис. 6.9. Соматический гипермутагенез генов, кодирующих вариабельные участки иммуноглобулинов.

На всех этапах дифференцировки В-лимфоцитов важную роль играют цитокины — гуморальные факторы регуляции иммунопоэза. Наиболее важными среди них являются фактор стволовых клеток (ФСК), ИЛ-2, ИЛ-7, BAFF. ФСК и ИЛ-7, регулируют процессы ранних этапов пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов. BAFF регулирует процессы превращения незрелых В-лимфоцитов в зрелые клетки, в том числе под его контролем находятся процессы селекции, необходимые для выбраковки аутореактивных клонов В-лимфоцитов. Все эти колониестимулирующие факторы продуцируются клетками стромы и микроокружения красного костного мозга. На стадии антигензависимой дифференцировки гуморальная регуляция осуществляется главным образом цитокинами, вырабатываемыми Т-хелперами 2-го типа, среди продуктов которых стоит выделить ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-5.

Практическая часть

Для оценки популяций и субпопуляций В-лимфоцитов необходимо знать их основ-

ные поверхностные маркеры, поскольку все методы, использующиеся для оценки популяций и субпопуляций лимфоцитов, основаны на применении моноклональных антител, специфичных к тому или иному маркеру, в зависимости от целей исследования.

Одним из наиболее распространенных методов выявления клеточных маркеров считается метод проточной цитофлуориметрии. С помощью проточной цитофлуориметрии, используя меченные флюоресцентной меткой моноклональные антитела, связывающиеся с определенными CD-маркерами, можно определить количество В-лимфоцитов, а также выделить различные по функции или стадии развития субпопуляции. Это позволяет диагностировать некоторые заболевания, оценить состояние пациента, прогнозировать дальнейшее течение болезни.

Принцип проточной цитофлуориметрии заключается в следующем. К клеточной суспензии, полученной из периферической крови или других тканей, содержащих изучаемые клетки, добавляются меченные флюоресцентной меткой моноклональные антитела, специфичные к одному или нескольким CD-маркерам лимфоцитов. Моноклональные антитела связываются только с теми клетками, на поверхности которых присутствует соответствующий CDантиген. Меченные таким образом клетки пропускаются через систему проточного цитофлуориметра, которая включает систему лазеров и фотодетектор. Лазерное излучение возбуждает свечение флюорохрома, связанного с моноклональными антителами, свечение которого будет фиксироваться фотодетектором. Таким образом, подсчи-

тывается количество клеток, связавшихся с моноклональными антителами. Кроме того, по светорассеянию лазерного луча определяются такие характеристики клеток, как размер и гранулярность цитоплазмы, что позволяет морфологически дифференцировать некоторые клетки.

Наиболее важным маркером для определения В-лимфоцитов является CD19: он

Рис. 6.10. Гистограмма, полученная с помощью проточного цитофлуориметра.

Рис. 6.11. Гистограмма, полученная с помощью проточного цитофлуориметра.

определяется на всех В-лимфоцитах, начиная со стадии про-В-клеток, поэтому В-лимфоциты обычно характеризуют как CD19+-клетки. Маркер CD21 появляется на поздних стадиях развития пре-В-клеток. Дифференцировать В-лимфоциты можно и по наличию В-клеточного рецептора. При этом незрелые В-лимфоциты экспрессируют на поверхности только IgM, а зрелые — IgM и IgD.

Субпопуляции B1 и В2 можно дифференцировать по экспрессии на поверхности маркера CD5: этот маркер присутствует только на поверхности В1-лимфоцитов, однако в некоторых случаях (в субпопуляции В1b) он может и отсутствовать.

Задача 1. На представленной гистограмме (рис. 6.10), полученной с помощью проточного цитофлуориметра, укажите популяцию B-лимфоцитов и их относительное количество. Какую еще популяцию лимфоцитов можно оценить по данной гистограмме?

Задача 2. На представленной гистограмме (рис. 6.11), полученной с помощью проточного цитофлуориметра, укажите субпопуляции B1 и В2-лимфоцитов и их относительное количество.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.Опишите строение антигенраспознающего рецептора В-лимфоцитов.

2.Назовите основные мембранные маркеры В-лимфоцитов.

3.Каковы основные особенности распознавания антигенов В-лимфоцитами?

4.Назовите и охарактеризуйте субпопуляции В-лимфоцитов.

6.РЕАРАНЖИРОВКА ГЕНОВ, ПРОХОДЯЩАЯ ВО ВРЕМЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В-ЛИМФОЦИТОВ, ЯВЛЯЕТСЯ

1)Считыванием генов, отвечающих за синтез маркеров В-лимфоцитов.

2)Перестройкой зародышевых генов тяжелых цепей иммуноглобулинов.

3)Удалением интронов из цепи ДНК.

4)Перестройкой зародышевых генов TCR.

5)Запуском считывания генов.

7.НА ПОВЕРХНОСТИ ЗРЕЛЫХ В-ЛИМФОЦИТОВ ПРИСУТСТВУЮТ

1)IgM.

2)IgG.

3)IgD.

4)CD19.

5)TCR.

8.ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ B-ЛИМФОЦИТОВ НЕОБХОДИМО ПРИСУТСТВИЕ

1)ФСК.

2)ИЛ-1.

3)ИЛ-7.

4)ИЛ-12.

5)ИЛ-6.

9.КОНЕЧНОЙ СТАДИЕЙ АНТИГЕНЗАВИСИМОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В-ЛИМФОЦИТОВ ЯВЛЯЮТСЯ

1)Фолликулярные клетки.

2)Зрелые В-лимфоциты.

3)Естественные киллеры.

4)В1-лимфоциты.

5)Плазматические клетки.

10.АНТИТЕЛА ПРОДУЦИРУЮТСЯ

1)Т-лимфоцитами.

2)Нейтрофилами.

3)Плазмоцитами.

4)В-лимфоцитами.

5)NK-клетками.

ОТВЕТЫ К‚ТЕСТОВЫМ ЗАДАНИЯМ

1 – 5.

2 – 3.

3 – 3, 4, 6.

4 – 3.

5 – 1, 2.

6 – 2.

7 – 1,2.

8 – 1,3.

9 – 5.

10 – 4.

Цель изучения темы: получить представление о системе цитокинов, классификации, свойствах, рецепторах, клетках-про- дуцентах, участии в иммунном ответе.

Требования к уровню подготовки студентов: необходимо иметь знания о популяциях клеток врожденного и адаптивного иммунитета, распознающих рецепторах, активации лимфоцитов.

Основные вопросы темы:

1.Классификация цитокинов.

2.Основные свойства цитокинов, понятие о цитокиновой сети.

3.Система цитокинов.

3.1.Характеристика клеток — продуцентов цитокинов во врожденном и адаптивном иммунитете. Понятие о Тh1, Th2 и Th17 субпопуляциях.

3.2.Характеристика цитокинов и их антагонистов.

3.3.Семейства рецепторов цитокинов.

4.Цитокины и воспаление, системные и локальные эффекты цитокинов.

Основные понятия и термины

Цитокины—классполипептидныхмедиа-

торов межклеточного взаимодействия (от лат. cytos — клетка), участвующих в развитии иммунных реакций при внедрении патогенов, а также в регуляции важных физиологических функций (воспаление, гемопоэз, эмбриогенез, регенерация тканей, ангиогенез и др.).

В настоящее время цитокины рассматривают как биорегуляторные молекулы, контролирующие разнообразные этапы

жизненного цикла клеток, включая процессы дифференцировки, пролиферации, функциональной активации и апоптоза.

Цитокины играют важную роль в осуществлении реакций как врожденного, так и адаптивного иммунитета, обеспечивают их взаимосвязь. В настоящее время известно около 200 цитокинов.

7.1. Классификация цитокинов

Существуют различные классификации цитокинов. На основе биологических эффектов принято выделять несколько групп цитокинов.

1.Интерлейкины (ИЛ-1−ИЛ-35) — регуляторные молекулы иммунной системы, обеспечивающие внутриклеточные медиаторные взаимодействия и связь иммунной системы

сдругими системами организма. Изначально предполагалось, что вновь открытые медиаторы осуществляют взаимодействие между представителями различных классов и популяций лейкоцитов — отсюда и термин интерлейкины. Соответственно, по клеточному происхождению, среди медиаторов выделяют те, что продуцируются клетками моноцмиар- но-макрофагального звена — монокины, и те, что продуцируются лимфоцитами, — лимфокины. Однако, наиболее широким остается, безусловно, термин «цитокины». Среди интерлейкинов выделяют провоспалительные цитокины, ростовые факторы лимфоцитов, регуляторные цитокины.

2.Факторы некроза опухоли — цитокины с цитотоксическим и регуляторным действием: ФНО-α и лимфотоксины (ЛТ).

3.Интерфероны — противовирусные агенты с выраженным иммунорегуляторным действием [интерфероны типа I — α, β, δ, κ, ω, τ; интерфероны типа II — γ; группа интерфероноподобных цитокинов, ИЛ-28A (ИФН-λ2), ИЛ-28B (ИФНλ3), ИЛ-29 (ИФНλ3)].

4.Факторы роста гемопоэтических клеток — факторы роста стволовых клеток (Kitлиганд, ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-11, эритропоэтин, тромбопоэтин, ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ), регулирующие гемопоэз.

5.Хемокины [СС, СХС (ИЛ-8), СХ3С, С] регулируют хемотаксис различных клеток.

6.Факторы роста участвуют в регуляции роста, дифференцировки и функциональных свойств клеток различных тканей (фактор роста фибробластов, фактор роста эндотелиальных клеток, фактор роста эпидермиса) и трансформирующий фактор роста (ТФР).

7.2.Основные свойства цитокинов, понятие о‚цитокиновой сети

Цитокины — это гликозилированные молекулы полипептидов или белков с молекулярной массой от 5 до 50 кДа).

Цитокины не обладают антигенной специфичностью, но могут стимулировать иммунный ответ на конкретные антигены.

Цитокины вырабатываются различными клетками организма, как правило,

вответ на активирующий стимул (патогенассоциированные молекулярные паттерны, антигены, цитокины и др.), но могут синтезироваться и конститутивно. Синтез цитокинов всегда начинается с транскрипции генов. Клетки вырабатывают цитокины

внизкой концентрации (пикограммы).

В большинстве случаев цитокины действуют кратковременно и короткодистантно на клетки-мишени.

Биологические эффекты цитокинов опосредуются через высокоспецифичные высокоаффинные мембранные рецепторы, которые представляют трансмембранные гликопротеины, включающие, как правило, несколько цепей. Внеклеточная часть рецепторов отвечает за связывание цитокина. Известны рецепторы, устраняющие избыток цитокинов в патологическом очаге. Это так называемые рецепторы-ловуш- ки. Растворимые рецепторы являются ферментативно отщепленным внеклеточным доменом мембранного рецептора. Растворимые рецепторы нейтрализуют цитокины и участвуют в выведении их из организма.

Избыточность системы цитокинов проявляется в том, что любую функцию конкретного цитокина дублируют другие молекулы. Поэтому мутация гена одного цитокина не вызывает развития иммунодефицита. Дублирование функций обеспечивает надежность работы системы цитокинов.

Плейотропность проявляется в следующем: один и тот же цитокин может действовать на многие клетки-мишени, вызывая различные эффекты. Так, проявление признаков воспаления обусловлено действием ИЛ-1, ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8.

Цитокины формируют цитокиновую сеть. В сети цитокины могут действовать согласованно (синергизм действия). Стимуляция воспалительных реакций ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-α — пример синергизма цитокинов.

Одни цитокины способны индуцировать синтез других цитокинов (каскад).

Действие цитокинов может быть антагонистическим: ИФН-γ тормозит выработку IgE В-лимфоцитами.

Цитокины действуют на клетки разными способами: аутокринно, паракринно, эндокринно. Провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α) могут обладать всеми тремя механизмами действия.

7.3.Система цитокинов

Внастоящее время цитокины рассматривают как универсальную систему регуляции на уровне целостного организма, обеспечивающую развитие иммунных реакций.

Внастоящее время сложилось представление о системе цитокинов, включающей: 1) клетки-продуценты; 2) цитокины и их антагонисты;

3) клетки-мишени, экспрессирующие рецепторы цитокинов (рис. 7.1)

Такое представление о системе цитокинов особенно важно для клинической практики. Выявление дефектов в данной системе важно для правильной постановки диагноза и назначения адекватного лечения.

Характеристика клеток-продуцентов во врожденном и адаптивном иммунитете. Понятие о Th1-, Th2-, Th17-субпопуляциях

I.Основные продуценты цитокинов

вреакциях врожденного иммунитета — клетки миелоидного происхождения.

После взаимодействия микроорганизмов или их компонентов с распознающими рецепторами врожденного иммунитета (паттерн-распознающими рецепторами, PRR) запускается внутриклеточный сигнальный каскад, приводящий к экспрессии генов двух основных групп цитокинов — провоспалительных и интерферонов типа I (рис. 7.2).

2.

•

•

Провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α, хемокины и др.) участвуют в развитии и регуляции воспаления и тем самым защищают организм от бактериальных инфекций.

Синтезируемые интерфероны I типа обеспечивают противовирусную защиту за счет:

1)прямого противовирусного действия — блокируя репликацию вируса;

2)подавления пролиферации клеток — препятствуя тем самым распространению вируса;

3)активации функции NK-клеток, лизирующих вирусинфицированные клетки;

4)увеличения презентации вирусных антигенов цитотоксическими Т-лимфо- цитами путем усиления экспрессии молекул МНС I класса на антигенпрезентирующих клетках.

Таким образом, ИФН, оказывая плейотропное действие, активирует различные механизмы, направленные на удаление вируса из организма.

II. В адаптивном иммунном ответе основные продуценты цитокинов — это Т-хелперы. Покоящиеся клетки не секретируют цитокины. При распознавании антигена происходит взаимодействие костимулирующих молекул СD28 на Т-лим- фоците и D80/86 — на дендритной клетке, которое передает в Т-лимфоциты сигналы, индуцирующие выработку цитокинов, и в первую очередь ИЛ-2.

По профилю продуцируемых цитокинов выделяют следующие субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов: Th1, Th2, Th17, Tfh, Th9 (продуценты ИЛ-9), а также индуци-

бельные регуляторные Т-клетки (iTreg) — Tr1 и Th3.

После созревания в тимусе наивные CD4+ Т-клетки дифференцируются на периферии в эффекторные Th1- и Th2-клетки.

Направление дифференцировки Th1

иTh2 определяют многие факторы, такие как природа антигена, тип ДК в тканях, набор цитокинов. Под влиянием бактериальных, вирусных агентов и сигналов опасности активируются TLR на ДК, которые индуцируют синтез ИЛ-12. Этот цитокин в дальнейшем активирует STAT4 и транскрипционный фактор Т-bet, который индуцирует Th1-ответ лимфоцитов (рис. 7.3, 7.4). Дифференцированные Th1-клетки вырабатывают ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-3, ФНО-α, -β, ГМ-КСФ, усиливающие клеточно-опосре- дованный иммунный ответ цитотоксического типа, направленный против вирусов, внутриклеточных патогенов и опухолей. Избыточная выработка Th1-цитокинов играет важную роль в патогенезе аутоиммунных процессов. В ряде случаев (при СПИДе, туберкулезе, малярии, вирусных инфекциях и др.) нарушается образование ИЛ-12, что приводит к ослаблению эффекторных цитотоксических реакций.

Тh2-клетки дифференцируются главным образом при действии ИЛ-4, который может синтезироваться ДК II типа (незрелыми), а также тучными клетками и базофилами в ответ на проникновение аллергенов, гельминтов, бактерий. Сам ИЛ-4 является аутокринным фактором роста Тh2-лимфоцитов. Дифференцировка Тh2клеток находится под контролем STAT6

итранскрипционного фактора GATA-3. Дифференцированные Th2-клетки выраба-