Клиническая фармакология часть 2 фармакогенетика

ние НОАК из-за отсутствия потребности в лабораторном контроле и лучшему профилю безопасности.

Действительно, при сравнении с варфарином использование НОАК (апиксабана, обеих доз дабигатрана и ривароксабана) в целом сопряжено с меньшим риском таких жизнеугрожающих осложнений как геморрагический инсульт и внутричерепное кровоизлияние. Однако, абсолютное число данных грозных осложнений уступает числу нецеребральных кровотечений, риск которых повышается при использовании любой антитромботической терапии. При оценке профиля безопасности конкретного препарата необходимо учитывать, что на основании учета совокупной частоты крупных кровотечений безопасностьдабигатранавдозе300 мгвсуткииривароксабанасравнима с варфарином, а апиксабана и дабигатрана в дозе 220 мг в сутки имеетпреимуществопередварфарином. Нарядусэтимприиспользовании дабигатранав дозе 300 мг в сутки и ривароксабана повышается относительныйрисккрупныхкровотеченийизжелудочно-кишечного тракта.

Основной сложностью терапии варфарином для практического здравоохранения является необходимость регулярного лабораторного контроля МНО.

С другой стороны, именно лабораторный контроль позволяет определить степень антикоагулянтного действия у конкретного пациента, что бывает важно в случаях развития кровотечения или перед хирургическим вмешательством.

Таким образом, учитывая накопленные данные, большой клинический опыт, а также принимая во внимание, что цена варфарина гораздо ниже НОАК, что особенно важно при учете пожизненной терапии, для практического здравоохранения варфарин остается основным пероральным антикоагулянтом для постоянного приема [].

Механизм действия и генетические факторы, определяющие чувствительность к варфарину.

Механизм действия варфарина состоит в ингибировании посттрансляционного γ–карбоксилирования) 4-х витамин К–зависимых факторов системы свертывания крови (протромбина, факторов VII, IX иX), атакжепротеинаСипротеинаS. Притерапииантагонистами

21

витамина К факторы свертывания крови, секретируемые гепатоцитами, содержат сниженное количество остатков γ–карбоксиглутами- новой аминокислоты (PIVKA – белки, образующиеся при дефиците витамина К). Они обладают сниженной способностью к активации в Са2+ – зависимых реакциях системы свертывания крови, что приводит к развитию состояния гипокоагуляции.

Варфаринпослевсасыванияиабсорбциивжелудкеитощейкишке прочно

и обратимо связывается с плазменным альбумином, достигает почек и фильтруется клубочками. Молекулы свободного варфарина, не связанные с альбумином, метаболизируют в печени путем гидроксилирования с образованием неактивных метаболитов. Период полужизни варфарина, составляет около 40–50 часов, однако его антикоагулянтное действие может сохраняется и в течение более продолжительного времени после отмены препарата.

Применяемые в настоящее время АВК такие как варфарин, аценокумарол, фенпрокумон представляют собой рацематические смеси S- и R-энантиомеров. S- и R-энантиомеры отличаются по своей антикоагулянтнойактивности. АнтикоагулянтнаяактивностьS-варфарина в пять раз выше активности R-варфарина.

ГлавнымферментомбиотрансформацииАВКявляетсяизофермент цитохрома Р-450 2С9 (СYР2С9). Следует отметить, что существуют значительные различия и в путях биотрансформации энантиомеров варфарина: S-варфарин окисляется под действием СYР2С9, в то время как R-энантиомер ‒ с участием СYР1А2, СYР2С19, СYР3А4. В результате метаболизма варфарина образуются неактивные метаболиты, главным из которых является S-7-гидроксиварфарин. Знание факторов, влияющих на индивидуальный ответ на варфарин, поможет в выборе дозы, необходимой для достижения достаточной антикоагуляции с меньшим числом серьезных осложнений. Последние данные свидетельствуют, что нуклеотидные полиморфизмы в генах, кодирующих белки, вовлеченные в метаболизм варфарина, определяют эффективную и безопасную дозу варфарина. Реакция пациента на варфарин также зависит от генома, поэтому фармакогенетика может помочь в определении дозы варфарина и уменьшении риска передозировки во время начала варфаринотерапии.

22

В отличие от варфарина S- и R-энантиомеры аценокумарола обладают одинаковой антикоагулянтной активностью. S-аценокумарол метаболизируется под действием СYР2С9, R-аценокумарол ‒ под действием СYР1А2,СУР2С19, СУР3А4. Все метаболиты аценокумарола неактивны.

S-энантиомер фенпрокумона по своей антикоагулянтной активности более чем в два раза превышает активность R-энантиомера. S- и R-энантиомеры фенпрокумона подвергаются биотрансформации в печени под действием СYР2С9 до неактивных 4-, 6-, 7- и 8-гидрок- симетаболитов. При этом главными путями биотрансформации как S-, так и R-фенпрокумона являются 4- и 7-гидроксилирование. Однако, несмотря на различия в биотрансформации S- и R-энатиомеров, общепризнано, что именно активность СYР2С9 определяет скорость биотрансформации непрямых антикоагулянтов. А изменение активности СYР2С9 под действием различных факторов, прежде всего генетических, как правило, приводит к клинически значимым изменениям концентрации препаратов.

За последние годы выполнен ряд исследований, посвященных изучению влияния носительства аллельных вариантов СYР2С9*2 и СYР2С9*3 на фармакокинетику, фармакодинамику, клиническую эффективность и безопасность варфарина, аценокумарола и фенпрокумона. В фармакокинетических исследованиях, выполненных на здоровых добровольцах, показано, что носительство «медленных» аллельных вариантов СYР2С9*2 и СУР2С9*3 ассоциируется с более высокими концентрациями 5-варфарина, 5-аценокумарола и 5-фен- прокумона, а также более низкими значениями их клиренса из-за замедления метаболизма этих препаратов [9, 10].

При назначении варфарина, аценокумарола и фенпрокумона у пациентов, являющихся носителями «медленных» аллельных вариантов СYР2С9*2 и СYР2С9*3, риск кровотечений возрастает в два-три раза, а чрезмерной гипокоагуляции (МНО более 4) ‒ в три-четыре раза [10-12]. У пациентов, являющихся носителями «медленных» аллельных вариантов СYР2С9*2 и СYР2С9*3, подобранная доза непрямых антикоагулянтов меньше, а терапевтические значения МНО удается достичь быстрее по сравнению с пациентами, не несущими данных аллельных вариантов. Расчитать начальную и поддерживаю-

23

щуюдозировкиварфаринавозможно, воспользовавшисьonlineкаль-

кулятором на сайте www.warfarindosing.ru.

Рисунок 1. Online-калькулятор для расчета дозы варфарина,

модель Gage et al.

Так, Sсоrdo и соавт. (2002) показали, что 72% пациентов, которым былаподобрананизкаядозаварфарина(менее26,25 мг/нед), былиносителямиаллелейСYР2С9*2 иСYР2С9*3 [33]. Адозааценокумарола для поддержания МНО в диапазоне 2-3 для пациентов с генотипом СYР2С9*1/*1 (169 пациентов) составляла 17,1 мг/нед. СYР2С9*1/*2 (97 пациентов) - 14,6 мг/нед, СYР2С9*1/*3 (59 пациентов) ‒ 11,2 мг/ нед [9].

Аналогичные данные были получены О.В. Сироткиной и соавт. (2004): носители аллельных вариантов СYР2С9*2 и СYР2С9*3 быстрее достигают терапевтического уровня гипокоагуляции и требуют достоверно меньшей недельной дозы варфарина [9].

Реуvandi и соавт. (2004) обнаружили, что у 65-66% больных, являющихся гомозиготами и гетерозиготами по аллелям СYР2С9*2 и

24

СYР2С9*3, через четыре дня после начала применения варфарина значение МНО приближается к 3. В то же время лишь 33% гомозигот СYР2С9*1/*1 через четыре дня терапии варфарином достигают уровня МНО, равное 3 [11].

В настоящее время кумаринорезистентность связывают с полиморфизмом генов, кодирующих компоненты витамин-К-эпоксидре- дуктазного комплекса (VКОR). Изначально были найдены различные аллельные варианты гена VКОR у крыс, которые обусловливали резистентностьэтихживотныхкразличнымядам, являющимсяпроизводными кумарина (так называемым крысиным ядам: бромодиолону, дифацинонуихлорофацинону) [12]. Предполагают, чтоквозникновению кумаринорезистентности у человека привела мутация гена, кодирующего субъединицу 1 этого комплекса (VКОRС1). VКОRС1 ‒ небольшой трансмембранный белок, локализованный в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов, являющийся мишенью для непрямых антикоагулянтов [38]. Наrrington и соавт. (2005) наблюдали 820 пациентов, принимающих варфарин, из них у четырех подобранная суточная доза этого препарата составляла 25 мг и более. У трех пациентовравновеснаяконцентрацияварфаринавплазмекровибыла в пределах терапевтического диапазона (0,7-2,3 мг/л)[10]. Один пациент оказался гетерозиготным носителем замены G196А. Кроме того, у него была определена высокая равновесная концентрация варфарина (5,7 мг/л). Эта замена была также выявлена у двух членов его семьи, которым не назначали данный препарат (авторы не уточняют степень родства). У других пациентов, принимавших варфарин, данная замена не была найдена. Полиморфный маркер G196А представлен заменой в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего VКОRС1, гуанина на аденин в 196-м положении, в результате чего происходит замена в аминокислотной последовательности VКОRС1 валина на метионин в 66-м положении (Vа166Меt). Авторы предполагают, что у носителей варианта 196А должна наблюдаться высокая активность витамин-К-эпоксидредуктазного комплекса, приводящая к кумаринорезистентности (39). Очевидно, что выявление одного пациента с кумаринорезистентностью, несущего замену G196→А в генеVKОRС1, ещенедоказываетналичиеассоциации. Всвязисэтим необходимо провести клинические исследования с участием больше-

25

го числа больных с кумаринорезистентностью с изучением фармакокинетики варфарина у этих пациентов.

Однако изменения в гене VKORС1 могут приводить не только к повышению, но и к понижению подобранных доз варфарина. D’Andrea и соавт. (2005) изучали влияние более распространенного полиморфного маркера C1173Т гена VKORC1 на режим дозирования варфарина у 147 пациентов[11]. Полиморфный маркер С1173Т представлен заменой в нуклеотидной последовательности гена VKORC1 цитозина на тимин в 1173-м положении (в интроне 1), что приводит к снижению экспрессии. Оказалось, что у пациентов с генотипом СС подобранная доза варфарина составляла 6,2 мг/сут, у пациентов с СТ генотипом ‒ 4,8 мг/сут, у пациентов с ТТ генотипом ‒ 3,5 мг/сут, при этом различия оказались статистически значимыми [11,12]. Аналогичные данные были получены Н.Р. Reitsma и соавт. (2006) у пациентов, применяющих другие непрямые антикоагулянты: аценокумарол и фенпрокумон [12].

Rieder исоавт. (2005) из10 заменвпромоторнойзонегенаVKORC1 выделили пять главных гаплотипов, которые определяли подобранную дозу варфарина [7]. Авторы разделили эти гаплотипы на две группы: низких доз варфарина (группа А, включающая гаплотипы Н1 и Н2) и высоких доз варфарина (группа В, включающая гаплотипы Н7, Н8 и Н9). Так, у пациентов с генотипом АА подобранная доза варфарина составила 2,7±0,2 мг/сут, у пациентов с генотипом АВ - 4,9±0,2 мг/сут, упациентовсгенотипомВВ‒6,2±0,3 мг/сут(р<0,001). Авторы показали, что у пациентов с генотипом АА происходит снижение экспрессии гена VKORC1. При этом наблюдали снижение содержания VKORC1 в гепатоцитах, что может объяснить применение более низких доз варфарина, необходимых для данной категории пациентов. У пациентов с генотипом ВВ наблюдали обратную ситуацию: повышение экспрессии гена VKORC1 приводило к более высокому содержанию VKORC1 в гепатоцитах, и, следовательно, этим пациентам требовалась более высокая доза варфарина [8].

Н.Y. Yuan и соавт. (2005) изучали влияние носительства генотипов по полиморфному маркеру G-1639А (в промоторной зоне) гена VKORC1 на фармакодинамику варфарина у 104 больных, принимающих данный препарат для профилактики тромбоэмболических

26

осложнений [12]. Оказалось, что генотип АА ассоциировался с высокой чувствительностью к варфарину, в то время как генотип GG ‒ с низкой чувствительностью к данному препарату, т.е. с кумаринорезистентностью. У китайцев этот генотип распространен с частотой 0 ‒ 2,7%, в то время как у европеоидов ‒ с частотой 39% [2]. I. Воdin

исоавт. (2005) также показали, что у здоровых добровольцев с генотипом АА по полиморфному маркеру G-1639А после однократного приемадругогонепрямогоантикоагулянтааценокумаролаактивность VII фактора свертывания снизилась более чем на 37%, а МНО увеличилосьболеечемна30%, чегонепроисходилоулицсгенотипамиАG

иGG [43]. Недавно С.L. Аquilante и соавт. (2006) провели изучение влияния носительства генотипов по новому полиморфному маркеру G3673А гена VKORC1 на недельные дозы варфарина у 350 пациентов. Оказалось, что недельная доза варфарина у пациентов с генотипом АА была достоверно ниже по сравнению с лицами с генотипами АG и GG (23,1±7 по сравнению с 32,9±11, р<0,0001 и 23,1±7 по срав-

нению с 45.6±17, р<0.0001 соответственно) [2].

По данным всероссийского многоцентрового рандомизированного исследования, среди пациентов РФ, нуждающихся в приёме НАК, частота носительства полиморфизмов генов повышающих чувствительность к варфарину составила: полиморфизмы VKORC1 ‒ 59%; полиморфизмы СYP2C9 ‒ 34%; сочетание любых полиморфизмов СYP2C9

иVKORC1 ‒ 20%; сочетание наиболее неблагоприятных в отношении риска кровотечения полиморфизмов СYP2C9 иVKORC1 ‒13% .

Еще одной проблемой использования АВК является наличие резистентности у пациентов к этим препаратам. При этом полиморфизм гена VKORC1 является не единственной генетической основой кумаринорезистентности.

Полиморфизм гена АРОЕ также может определять дозу варфарина длядостижениятерапевтическогоуровнягипокоагуляции. АРОЕ ‒ген, кодирующийаполипопротеинЕ(АРО-Е), локализованныйнамембране гепатоцитов и осуществляющий «захват» ими витамина К. Так, Kohnke

исоавт. (2005) показали, чтоуносителейаллеляАРОЕ*Е4 наблюдается болееинтенсивныйзахватгепатоцитамивитаминаК, поэтомунеудивительно, что таким пациентам требовалась большая доза варфарина для достижениятерапевтическогоуровнягипокоагуляции[2].

27

Таким образом, изучение полиморфных маркеров генов, изменения в которых могут приводить к кумаринорезистентности (VKORC1 и АРОЕ), а также генов, изменения в которых обусловливают повышенную чувствительность к непрямым антикоагулянтам (СYР2С9, VKORC1), является перспективным подходом, позволяющим индивидуализировать терапию непрямыми антикоагулянтами. В будущем ожидают появления генетического чипа, с помощью которого можно будетпрогнозироватьчувствительностьпациентовкнепрямымантикоагулянтам, что позволит выбирать оптимальный режим дозирования препаратов. По-видимому, подобный подход будет способствовать повышению эффективности и безопасности фармакотерапии непрямыми антикоагулянтами.

Несколько алгоритмов дозирования для прогнозирования необходимой дозы варфарина, которые включают клинические факторы и демографические переменные, были утверждены в клинической практикевпоследниегоды[6-8]. Недавноинформация, получаемаяиз генетических исследований, была также реализована в этих моделях. Алгоритмы, включающие фармакогенетику для определения дозы варфарина, показывают, что возможно уменьшить риск осложнений, связанных с передозировкой во время индукции варфарина [2].

В 2007 году Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами США (FDA) утвердила дополнение к информации по назначению варфарина, предлагающее назначать варфарин, основываясь на генетическом анализе [4].

Поданнымцентрагемостазаг. Архангельскафармакогенетическое тестированиебылопроведеноу91 пациентанабазеДНК-лаборатории Северного государственного медицинского университета (СГМУ). Стандартная доза варфарина сравнивалась с фармакогенетической, расcчитанной по алгоритму Gage [2].

Кроме того, генетический анализ не является широко доступным. Поэтому другие исследователи предпочитают стандартизированные схемы назначения варфарина без генетического тестирования. В ис- следованииЛазо-Лэнгнераисотрудниковбылопоказано, чтостандартизированное назначение варфарина безопасно, и поддерживающую дозу варфарина можно точно спрогнозировать, учитывая индивидуальную реакцию пациента на введение препарата, т.е. без необходи-

28

мости в дорогом генетическом анализе [10]. Такие клинические исходы, как кровотечения, редки у пациентов антикоагулянтных клиник, есливарфаринотерапияиндивидуализированаитщательноконтролируется. Втакихслучаяхгенетическийанализзначительнонеулучшит безопасность терапии. Поэтому в настоящее время генотипирование не является вариантом скрининга всех пациентов. Тем не менее, нет единого мнения относительно того, каким группам пациентов было бы выгодно проводить подобный скрининг.

Такимобразом, фармакогенетическоетестированиевклинической практике целесообразно проводить:

у пациентов с высоким риском развития НЛР;

перед назначением ЛС с узким терапевтическим диапазоном;

перед назначением ЛС с большим спектром НЛР;

перед назначением ЛС, которое вызывает НЛР;

если планируют длительное применение ЛС.

Методика генотипирования

(цитируется из «Исследование Фармакогенетики Варфарина и Клопидогрела для оптимизации антитромботической терапии» [11])

Специальной подготовки к исследованию не требуется. Источником генетического материала для анализа обычно служит цельная кровь, забор которой происходит в пробирку с консервантом (ЭДТА). После взятия крови пробирку несколько раз переворачивают для предотвращения образования сгустков.

Генотипирование чувствительности к варфарину проводится методом полимеразой цепной реакции (ПЦР) с анализом кривых плавления. Данный метод молекулярной диагностики является наиболее эффективным и широко распространенным в сфере фармакогенетических исследований in vitro. Принципиальным преимуществом его использования является возможность выявления генетически обусловленной чувствительности пациента к лекарственным веществам и определения индивидуальной дозы препарата на начальном этапе лечения.

ПринципметодаПЦРбазируетсянаамплификации(многократном

29

увеличении) определенных фрагментов ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы и праймеров – искусственно синтезированных олигонуклеотидов, которые идентичны искомым участкам ДНК-мишени инеобходимыдляначаласинтезакомплементарнойцепи. Дляидентификации образовавшихся продуктов амплификации (ампликонов) используются зонды – искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера, соединенные с флуоресцентными метками. В результате специфического взаимодействия зондов с ампликонами происходитвысвобождениеметкии, какследствие, наблюдаетсяфлуоресценция.

Наиболее эффективным вариантом метода ПЦР на современном этапе является ПЦР с детекцией результатов в режиме «реального времени» – ПЦР-РВ.

Вэтом случае амплификация фрагментов генов и их идентификация путем измерения флуоресценции проходят одновременно, что существенно сокращает

время проведения анализа от момента взятия материала до выдачи результатов исследования. Для определения генетически обусловленной чувствительности к варфарину использование метода ПЦР-РВ особенно актуально с точки зрения возможности получения данных

офармакогенетических особенностях пациента в ближайшие сутки, так как это позволяет снизить риск развития кровотечения в результате передозировки препарата при подборе индивидуальной дозы у больных.

Воснове генетических особенностей, обусловливающих индивидуальную

чувствительность к варфарину, лежат одиночные нуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphisms – SNPs) – CYP2С9, VKORC1, CYP4F2 (подробно – см. главу IV). Для их выявления методом ПЦР в режиме «реального времени» были использованы комплекты реагентов и детектирующий амплификатор серии ДТ производства компании «ДНК-Технология».

Предлагаемый компанией «ДНК-Технология» подход позволяет минимизировать ошибку интерпретации аллельных вариантов, обеспечивает максимальную стабильность и воспроизводимость результатов.

30