Волков Г. Л. Современные представления о системе гемостаза

Кроме общепринятых методов лабораторной диагностики в комплекс включены методы, разработанные на основе использования активаторов проферментов системы свертывания крови, выделенных из яда змей, кото­ рые являются удобным инструментом для применения в диагностических тестах. Используемый комплекс диагностических тестов дает возможность контролировать накопление маркеров тромбофилии и эффективность анти­ коагулянтной терапии [10, И].

При разработке комплекса диагностических тестов особое внимание уделяли методам, предназначенным для выявления маркеров тромбинемии: определение содержания фибриногена, РФМК, продуктов расщепления фибриногена/фибрина, функционально неактивных форм протромбина, определение активности протеина С и антитромбина III. Для характеристи­ ки системы фибринолиза разработаны тесты, позволяющие определять ак­ тивность ТАП и ПАИ-1.

Тесты апробированы на плазме крови больных при заболеваниях серде­ чно-сосудистой системы (стенокардия, инфаркт, инсульт), язвенной болез-

230

5.3. Комплексная лабораторная диагностика нарушений системы свертывания крови и фибринолиза

ни, гломерулонефрите, осложнениях при беременности, хирургических вме­ шательствах, ожогах и других патологических состояниях [24—39].

Использование тромбиноподобного фермента анцистрона-Н для определе­ ния содержания фибриногена в плазме крови. Содержание фибриногена в пла­ зме крови — один из важных показателей, характеризующих состояние сис­ темы гемостаза. Биосинтез данного белка усиливается в ответ на травму, в послеоперационный период, при инфекционных болезнях, сердечно-сосу­ дистых заболеваниях, воспалительных и других процессах (гиперфибрино­ генемия). В связи с этим он получил название “белок острой фазы”. Гипо­ фибриногенемия может быть вызвана потреблением фибриногена при ДВС-синдроме, дилюционной коагулопатии, введении фибринолитических препаратов [2, 40, 41].

Эпидемиологическими исследованиями обнаружен высокий уровень корреляции между содержанием фибриногена в плазме крови и развитием двух основных тромботических осложнений: инсульта и инфаркта миокарда. Главным механизмом при данных осложнениях является процесс образова­ ния тромба, ключевую роль в котором играет фибриноген, поскольку фаза фибринообразования — одна из решающих в развитии тромбоза. Понима­ ние связи между тромбозом и содержанием фибриногена в плазме крови да­ ет возможность своевременного проведения лечения для предупреждения возникновения тромботических осложнений.

Таким образом, определение количества фибриногена в плазме крови име­ ет важное диагностическое значение и может быть прогностическим фактором при многих патологических состояниях, связанных с нарушением системы ге­ мостаза и сопровождающихся развитием тромботических осложнений.

Содержание фибриногена в плазме крови определяют с помощью тром­ бина и тромбиноподобных ферментов. Известно несколько методов, кото­ рые чаще всего используются в клинической практике: метод Клаусса и гравиметрический метод Рутберг.

Широко используемый в зарубежной клинической практике, метод Клаусса позволяет быстро определять содержание фибриногена, однако он предусматривает ежедневный контроль реактивов и построение калибровоч­ ной кривой по референтной плазме крови, что значительно усложняет про­ водимый анализ.

Метод определения содержания фибриногена по Рутберг наименее стандартизован. Неконтролируемые детали этого метода дают недостовер­ ные и расходящиеся результаты определений: неполное удаление влаги при­ водит к завышенным результатам, задержка процедуры взвешивания на 1—2 мин в ходе выполнения измерений — к ошибке на 2—4 %. Вариации ре­ зультатов определения содержания фибриногена гравиметрическим мето­ дом в разных лабораториях могут достигать от 50 до 100 % [1].

Мы проводили определение содержания фибриногена по методу Белицера и Варецкой. Принцип метода состоит в том, что под действием экзо­ генного тромбина в исследуемой плазме крови достигается полное превра­ щение фибриногена в фибрин. Образовавшийся сгусток отжимали на стек­ лянной палочке и растворяли в уксусной кислоте. Содержание фибриногена определяли спектрофотометрически [12, 15].

231

5.3. Комплексная лабораторная диагностика нарушений системы свертывания крови и фибринолиза

Таблица 5.2. Содержание фибриногена в плазме крови пациентов с гипертензией

Содержания фибриногена, г/л

В норме время свертывания плазмы крови доноров в тесте АЧТВ составляет 55 с, содержание фибри­ ногена — 2,4 + 0,3 г/л, антитромбина III — 100 ± 14 %.

Вторичные ингибиторы могут накапливаться в плазме крови и замед­ лять скорость свертывания крови при воспалительных процессах, стрессе, осложнениях при беременности, онкологических, сердечно-сосудистых за­ болеваниях, системной красной волчанке.

Анцистроновое время (АВ). Второй тест, в котором используется тромби­

ноподобный фермент анцистрон-Н, является аналогом рептилазного време­ ни (рис. 5.2). В отличие от тромбинового времени (ТВ) тест чувствителен к накоплению продуктов деградации фибриногена (ПРФ) — ингибиторов свертывания фибрина. Сравнение ТВ и АВ позволяет характеризовать завер­ шающий этап процесса свертывания крови и дифференцировать причины удлинения времени свертывания в тесте ТВ [10, 29]. Алгоритм использова­ ния теста АВ представлен ниже.

Оценка состояния системы гемостаза при помощи анцистрона-Н

Сравнение эффективности тестов “анцистроновое время” и подобного ему “атроксин/тромбиновое время” (фирма “Sigma”, США) подтвердили чувствительность и точность теста “анцистроновое время”.

233

ГЛ АВ А 5. Анализ состояния системы гемостаза

Одновременное сокращение времени свертывания плазмы крови в тестах ТВ и АВ является показателем развития тром­ бофилии.

Содержание растворимых фибрин-мо­ номерных комплексов (РФМК). Принцип паракоагуляционных тестов, используе­ мых в клинической практике для выяв­ ления растворимых фибрин-мономерных

лекса, с последующей полимеризацией его и образованием геля.

Учитывая низкую специфичность выполняемых в клинической практике тестов, в наших исследованиях был использован метод выявления РФМК, ра­ зработанный В.А. Белицером и Т.В. Варецкой, основанный на реакции пара­ коагуляции в присутствии фосфатных буферов. Фосфатные буферы позволя­ ют оптимизировать условия теста, при которых фибриноген и ПРФ соосаждаются в незначительных количествах [12]. Тест выполняется следующим об­ разом: в центрифужные пробирки вносят: 0,25 мл исследуемой плазмы; 0,25 мл 0,1 М дигидрофосфатного буфера (КН2РО4 + NaOH) pH 7,5, содер­ жащего 0,065 М NaCl; 0,2 % 6-АГК и 0,1 %-й раствор цитрат натрия. Смесь тщательно перемешивают, добавляют 0,4 мл 1 М фосфатного буфера pH 7,5, перемешивают и оставляют на 30 мин при температуре 22 °C. Результаты оце­ нивают полуколичественно по форме и количеству появляющегося осадка: мелкие частички — 0,035 мг/мл (1 условная единица — у.е.); хлопьевидная муть — 0,07 мг/мл (2 у.е.); хлопья, нити — 0,105 мг/мл (3 у.е.); гелеобразный осадок — 0,14 мг/мл (4 у.е.). Количество РФМК определяют по калибровоч­ ному графику, полученному на модельной системе, составленной из плазмы крови доноров и определенных количеств мономерного фибрина [10, 15, 23].

Определение содержания ПРФ. ПРФ являются вторичными антикоагу­ лянтами, тормозящими образование фибринового сгустка. Тест основан на определении степени замедления времени полимеризации препарата моно­ мерного фибрина в присутствии исследуемой плазмы крови, содержащей ПРФ. Степень удлинения времени формирования сгустка в тесте прямо пропорциональна концентрации ПРФ [10, 15].

Определение общего уровня протромбина и его функционально неактивных форм с помощью ферментного препарата экамулина. Для установления со­ держания протромбина в плазме крови и выявления его функционально не­ активных форм использовали активатор протромбина — экамулин, выде­ ленный нами из яда эфы многочешуйчатой (Echis multisquamatus). По свойс­ твам этот фермент подобен экарину, выделенному из яда эфы песчаной

(Echis carinatus), который широко используется в зарубежной клинической практике [44, 45].

В отличие от тромбопластина экамулин способен активировать непос­ редственно протромбин, не активируя весь каскад системы свертывания

234

ГЛ А В А 5. Анализ состояния системы гемостаза

ных производных. Одна из основных форм производных — претромбин, об­ разующийся при отщеплении тромбином Gla-домена и первого крингла мо­ лекулы протромбина, который при этом теряет способность связываться с фосфолипидной мембраной и является физиологически неактивным. Выяв­ ление таких функционально неактивных молекул важно для диагностики тромбофилии.

Результаты теста экамулиновое время могут быть представлены в виде

экамулинового индекса — соотношения времени свертывания плазмы крови доноров и исследуемой плазмы крови. При накоплении в плазме крови фун­ кционально неактивных форм протромбина экамулиновый индекс выше протромбинового. Значение экамулинового индекса соответствует общему уровню протромбина в плазме крови: сумме функционально активных и не­ активных форм. Содержание функционально неактивных форм протромби­ на можно определить по разнице между протромбиновым и экамулиновым индексами. Если ЭИ выше ПИ на 10—20 %, то плазма крови больного со­ держит 1,2 мкг/мл функционально неактивных форм протромбина; если раз­ ница соответствует 20—40 % — 2,4 мкг/мл; 40—60 % — 3,6 мкг/мл. Эти вели­ чины получены при исследовании влияния препаратов претромбина на вре­ мя свертывания плазмы крови доноров в тесте экамулиновое время [47].

Сравнение результатов протромбинового и экамулинового тестов по­ зволяет выявить функционально неактивные формы протромбина и опреде­ лить их содержание. Уровень накопления таких форм характеризует степень активации системы свертывания крови. Этот показатель может быть инфор­ мативен при оценке эффективности проводимой антитромботической тера­ пии.

Информативность теста проверена в ходе анализа 102 образцов плазмы крови больных, оперированных по поводу абдоминальных кровотечений при язве желудка. Группы больных были составлены по степени тяжести протекания послеоперационного периода: 1 группа — стабильное состояние, II — тяжелое, III — летальный исход. Представленные данные иллюстриру­ ют корреляцию между снижением уровня протеина С и накоплением функ­ ционально неактивных форм протромбина, что подтверждает активацию процесса свертывания крови (табл. 5.3).

Таблица 5.3. Показатели гемостаза в группах больных, оперированных по поводу абдоминальных кро­

вотечений при язве желудка (S + SD)

(pl-3 < 0,05; р2—3 < 0,05)

236

5.3. Комплексная лабораторная диагностика нарушений системы свертывания крови и фибринолиза

Определение содержания физиологических ингибиторов системы сверты­

вания крови. К основным ингибиторам свертывания крови относятся анти­ тромбин III и протеин С. Антитромбин III является ингибитором тромбина, а также ХПа, Xia, IXa, Ха, Vila факторов системы свертывания крови. В на­ ших исследованиях для определения содержания антитромбина III исполь­ зовали метод [5, 10].

Активированный протеин С выборочно расщепляет факторы свертыва­ ния Va и Villa. Определение содержания функционально активного протеи­ на С имеет важное значение для оценки антикоагуляционного потенциала крови. Активация системы свертывания крови приводит к снижению содер­ жания протеина С.

Для определения активности протеина С ранее использовали неспеци­ фические активаторы — тромбин, трипсин и активатор фактора X, выде­ ленный из яда гадюки Рассела. Однако для ускорения этого процесса тре­ бовалось наличие кофакторов, например тромбомодулина. В связи с этим определение уровня протеина С было технически сложным. В 1986 г. пока­ зано, что яд Agkistrodon contortrix contortrix способен активировать протеин С. Впоследствии из яда этой змеи был выделен активатор протеина С, из­ вестный как Protac. Аналогичные по действию ферменты-активаторы об­ наружены также в яде змей рода Agkistrodon (A. contortrix contortrix, А. с. piscivorus, А. с. pictigaster, А. с. mokeson, A. bilineatus, A. piscivorus leucostomd)

[45].

Активаторы протеина С, содержащиеся в яде змей, исключают исполь­ зование комплекса тромбин-тромбомодулин. Преимущество нефизиоло­ гических активаторов протеина С, выделенных из яда змей, состоит в их специфичности, высокой скорости активации протеина С, отсутствии в плазме крови их ингибиторов, а также в их резистентности к высокой ион­ ной силе, что дает возможность использовать их для определения уровня протеина С in vitro. В отличие от иммунологических тестов, применение которых позволяет найти только содержание протеина С, тесты с исполь­ зованием активатора протеина С характеризуют функциональную актив­ ность этого белка.

Для определения активности протеина С из яда щитомордника обыкно­ венного {Agkistrodon halys halys) нами был выделен фермент — активатор протеина С. Сравнение его действия с действием фирменного препарата Protac (American diagnostica, США) показало идентичность влияния обоих препаратов [10, 48].

Принцип метода определения активности протеина С в плазме крови заключается в его способности инактивировать факторы Va и Villa, что приводит к удлинению времени свертывания плазмы крови в тесте АЧТВ в присутствии активатора протеина С. При дефиците протеина С время свер­ тывания плазмы крови сокращается [3, 10, 19, 20].

Активация системы свертывания крови сопровождается снижением содержания протеина С и к накоплению маркеров тромбинемии — РФМК, функционально неактивных форм протромбина. В табл. 5.4 представлены данные, характеризующие состояние системы гемостаза беременных при гестозе.

237

ГЛ АВ А 5. Анализ состояния системы гемостаза

Таблица 5.4. Содержание протеина С и маркеров тромбинемии: растворимого фибрина, функцио'

нально неактивных с>орм протромбина у беременных при гестозах

свертывания крови: накопление маркеров тромбинемии (РФМК и функци­ онально неактивных форм протромбина) и потребление одного из основных ингибиторов этой системы — протеина С, что характеризует нарушение ба­ ланса между прокоагулянтным звеном и ингибиторами.

Характеристика параметров фибринолитической системы

Методы определения активности тканевого активатора плазиминогена в эуглобулиновой фракции плазмы крови и ингибитора активатора плазминогена первого типа в плазме крови.

В процессе фибринолиза непосредственное участие принимает специ­ фический фермент крови — плазмин, который образуется из своего неакти­ вного предшественника — плазминогена. Активацию плазминогена в физи­ ологических условиях осуществляют ТАП и активатор урокиназного типа. Действие ферментов фибринолиза находится под контролем их ингибито­ ров, основными из которых являются а2-антиплазмин — специфический ингибитор плазмина и ингибитор активатора плазминогена первого типа (ПАИ-1).

Для характеристики системы фибринолиза чаще всего выполняется тест, устанавливающий общую фибринолитическую активность. Для более детальной характеристики фибринолитического потенциала рекомендует­ ся определение содержания/активности компонентов системы фибрино­ лиза.

В наших исследованиях мы находили содержание плазминогена и а2-антиплазмина с помощью хромогенных субстратов [21].

Для установления активности ТАП в плазме крови мы адаптировали ме­ тод определения этого показателя в крови больных с различными патологи­ ями, связанными с нарушениями системы гемостаза [22, 23, 37].

Принцип метода заключается в способности тканевого активатора плаз­ миногена в присутствии стимулятора превращать плазминоген в плазмин. Плазмин расщепляет хромогенный субстрат с высвобождением в раствор паранитроанилида, изменение его оптической плотности измеряли при 405 нм. В норме активность ТАП составляет 2,05 МЕ/мл, снижение его ак­ тивности свидетельствует о возможной угрозе тромботического осложне­ ния, повышение — о предрасположенности к геморрагиям [23].

Из рис. 5.4 видно, что изменение активности ТАП носит разнонаправ­ ленный характер. Активность ТАП является важным информативным пока-

238