Волков Г. Л. Современные представления о системе гемостаза

ГЛАВА2. Молекулярные основы свертывания крови

формы дефицита антитромбина III распространены довольно широко и свя­ заны с нарушением синтеза белка при заболевании печени, ускоренным ка­ таболизмом вследствие взаимодействия с тромбином, эластазой и гепари­ ном. Усиленное образование тромбина при ряде патологических состояний сопровождается потреблением антитромбина III.

а2-Макроглобулин (а2-М) — гликопротеин плазмы крови, ингибиторный потенциал которого составляет 25—30 % всего антитромбинового потенциала плазмы крови. Известны две функции а2-М. Первая связана с быстрым и свое­ временным выводом из кровотока комплексов ингибиторов (антитромбина III, а2-антиплазмина, Cl-эстеразы) с соответствующими ферментами, вто­ рая — при низкой концентрации вышеуказанных ингибиторов а2-М выпол­ няет функцию ингибирования активированных протеиназ крови. а2-М при­ нимает участие в иммунных реакциях, влияя на ответ иммунокомпетентных клеток на разные стимулы, а также контролирует способность макрофагов и нейтрофилов мигрировать в области воспаления. Макроглобулин определяет интенсивность синтеза и высвобождение некоторых растворимых медиато­ ров, регулируя интенсивность взаимодействия сенсибилизированных лимфо­ цитов со специфическим антигеном. Его значение возрастает при унаследо­ ванном или приобретенном дефиците основных ингибиторов протеиназ [33].

2.2. СИСТЕМА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ

2.2.1. Ферментативный каскад системы

свертывания крови

Система свертывания крови является одной из основных составных частей гемостаза. Плазменный (коагуляционный) гемостаз — это многоэтапный ферментативный процесс, в котором участвуют белки плаз­ мы крови и тканей, надмолекулярные структуры и ионы кальция. Коагуля­ ционный гемостаз, хотя и называется вторичным, осуществляется не строго последовательно вслед за сосудисто-тромбоцитарным (первичным) гемоста­ зом, а функционирует при взаимодействии с этим звеном.

Необходимым компонентом процесса свертывания крови in vivo являют­ ся тромбоциты. Агрегированные активированные тромбоциты обеспечивают эквивалентную прокоагулянтам отрицательно заряженную фосфолипидную поверхность, на которой локализуются реакции, катализируемые многоком­ понентными комплексами. Кроме того, тромбоциты представляют собой депо белков, участвующих в процессе свертывания крови и его регуляции, и определяют особенности механизма функционирования гемостаза (локали­ зация ответа, усиление прокоагулянтной активности и предупреждение кро­ вотечения при повреждении сосуда). Участие тромбоцитов в процессе свер­ тывания крови подтверждается тем, что при введении фармакологических количеств мощного антагониста тромбоцитов, такого как простагландин Ен значительно удлиняется время свертывания крови и подавляется образова­ ние тромбина [131, 132].

120

2.2. Система свертывания крови и ее регуляция

Конечной целью коагуляционного гемостаза является превращение фиб­ риногена в фибрин и последующее формирование фибринового сгустка, ко­ торый повышает плотность первичного тромба и закрепляет его на сосудис­ той стенке в месте повреждения.

С биохимической точки зрения механизм свертывания крови и образо­ вания сгустка представляет каскад последовательных ферментативных реак­ ций, которые осуществляются группой специфических белков — факторов системы свертывания. Каждый активированный фактор активирует следую­ щий путем ограниченного протеолиза, превращая профермент в фермент. Все плазменные факторы свертывания крови в неактивном состоянии обоз­ начаются римскими цифрами, а их активные формы маркируются прибав­ лением к номеру фактора буквы “а”. Многие прокоагулянты были открыты при исследовании системы свертывания крови больных с наследственными коагулопатиями, поэтому ряд факторов назван по фамилиям впервые выяв­ ленных носителей дефекта (факторы Хагемана, Кристмаса, Стюарта, фон Виллебранда) [1,2, 15, 18].

Большая часть реакций каскада системы свертывания крови протекает не в свободном растворе, где они слишком рассеянны, а на поверхности фо­ сфолипидных мембран, активированных тромбоцитов, лейкоцитов, эндоте­ лиальных клеток в присутствии ионов кальция и белковых кофакторов, ко­ торые изменяют конформацию профермента и отвечают за определенное сродство белковых компонентов друг к другу и к отрицательно заряженной фосфолипидной мембране [133, 134].

Эффективность ферментативного действия комплексов, которые соби­ раются при участии ионов кальция на поверхности фосфолипидных мем­ бран и состоят из витамин К-зависимой сериновой протеиназы и не обла­ дающего ферментативной активностью кофакторного белка, превышает каталитическую эффективность отдельных ферментов в 2,5 • 105 — 2 ■ 109 раза [18].

Каждая последующая стадия проходит с большей скоростью, чем пре­ дыдущая, и первичный сигнал значительно усиливается за счет повышения на каждом этапе свертывания крови количества следующего компонента, принимающего участие в этом процессе. Небольшое количество активиро­ ванного фактора на начальных этапах процесса активации системы сверты­ вания вызывает лавинообразное усиление на последующих стадиях и как ре­ зультат — быструю реакцию организма на травму [135, 136].

Кроме того, широко распространен механизм положительной обратной связи, оказывающий содействие ускорению реакций начальных этапов свертывания крови. Например, фактор Ха и тромбин, активируя факторы V и VIII, значительно ускоряют процесс образования тромбина. Более того, тромбин является клеточным агонистом, который способен стимулировать тромбоциты и эндотелиальные клетки, что приводит к экспонированию отрицательно заряженных фосфолипидов на поверхности клеточных мем­ бран [15, 136].

Таким образом, биологическое значение этого сложного многоступен­ чатого ферментативного процесса состоит в том, что от момента запуска до

121

Г Л АВ А 2. Молекулярные основы свертывания крови

конечного этапа происходит возрастание скорости протекания каждого по­ следующего этапа и интенсивное наращивание содержимого компонентов каждого следующего этапа активации.

Процесс функционирования каскада реакций свертывания крови услов­ но делят на три фазы [1, 135].

Первая фаза — образование протромбиназного комплекса. Весь каскад активации факторов как внутреннего, так и внешнего пути системы сверты­ вания крови направлен на преобразование фактора X в активированный фак­ тор Ха и на формирование протромбиназного комплекса, который превра­ щает протромбин в тромбин.

Вторая фаза — тромбинообразование. Протромбиназиый комплекс (факторы коагуляции Ха, Va, ионы кальция) на фосфолипидной мембране переводит неактивный фактор II (протромбин) в активный фактор Па (тром­ бин). Активация протромбина является важным звеном каскада реакций коагуляционного гемостаза, которые ведут к образованию мультифункционального фермента — тромбина, играющего ключевую роль в регуляции системы гемостаза.

Третья фаза свертывания крови —- фибринообразование. Образовав­ шийся тромбин отщепляет от молекулы фибриногена фибринопептиды, превращает его в фибрин-мономер, что сопровождается экспонированием специфических центров полимеризации. Молекулы фибрин-мономера, вза­ имодействуя по специфическим центрам полимеризации, образуют двунит­ чатые структуры — протофибриллы, которые латерально ассоциируют в фи­ бриллы и образуют фибриновую сеть. Кроме того, тромбин активирует фак­ тор XIII в фактор ХШа. Последний в присутствии ионов кальция ковалент­ но прошивает фибриновый полимер, превращая его в стабильную форму, которая и составляет основу кровяного сгустка.

В зависимости от пути формирования протромбиназы различают внут­ ренний и внешний пути ее образования. Связь с фосфолипидными мембра­ нами и дальнейшая взаимосвязь между факторами свертывания крови при активации происходит за счет белок-белковых взаимодействий, включаю­ щих взаимодействие IXa-VIIIa (теназа внутреннего пути) или взаимодейст­ вие фактора VII с апопротеином тканевого фактора, в результате чего обра­ зуется активный комплекс тканевый фактор-VHa, который называют теназа внешнего пути свертывания крови (рис. 2.10).

Основным критерием для разделения внешнего и внутреннего путей свертывания крови служит источник клеточных мембран, на поверхности которых протекают ферментативные реакции. Для активации факторов вну­ треннего пути свертывания крови источником отрицательно заряженных мембран являются активированные тромбоциты, а для факторов внешнего пути — мембраны эндотелиальных клеток и других тканей, с которыми кровь вступает в контакт при ранении.

Внутренний механизм свертывания крови реализуется с участием ряда факторов системы свертывания крови (XII, XI, IX, VIII, X), калликреин-ки- ниновой системы и тромбоцитов. Детальное изучение in vitro белок-белко­ вых взаимодействий при формировании ансамбля компонентов контактной системы на анионной поверхности (каолин, сульфаимиды, декстрансульфа-

122

2.2. Система свертывания крови и ее регуляция

ходима для инициирования, усиления и распространения защитных реак­ ций организма, которые обеспечиваются этими и другими системами, с ни­ ми взаимодействующими. Ферменты контактной системы активируют плаз­ миноген, первый компонент (С1) и фактор В комплемента, фактор VII сис­ темы свертывания крови и проренин, а также стимулируют активацию нейт­ рофилов и влияют на функцию эндотелиоцитов непосредственно либо через высвобождение брадикинина. Особенно следует подчеркнуть влияние бра­ дикинина на процесс высвобождения цитокинов, таких как интерлейкин-1, фактор некроза опухолей и других вторично генерируемых медиаторов: NO, простагландинов и лейкотриенов [149].

Внешний путь свертывания крови ранее рассматривался как резервный, мобилизующийся организмом при чрезвычайных обстоятельствах, обуслов­ ливающий быстрое свертывание крови. Однако, согласно современным представлениям, внешний путь свертывания крови, индуцируемый ткане­ вым фактором, является основным механизмом тромбогенеза в сосудистом русле [1, 18, 44, 145—148].

Тканевый фактор — трансмембранный гликопротеин, содержащийся в мембранах эндотелиальных и гладкомышечных клеток, моноцитов, макро­ фагов, функционирует не самостоятельно, а в комплексе с фосфолипидной матрицей, которая в процессе повреждения внешней клеточной мембраны теряет нормальное асимметрическое распределение липидов, что сопровож­ дается переходом молекул фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина с внутреннего листка бислоя мембраны на внешний.

Свертывание крови инициируется тканевым фактором, который экс­ прессируется на клеточных поверхностях при повреждении ткани и образует эквимолярный комплекс с фактором Vila (рис. 2.12). Фактор Vila, присутст­ вующий в кровотоке в небольшом количестве (0,5—1,0 % фактора VII), име­ ет конформацию, которая не позволяет ему контактировать с плазменными факторами свертывания крови и активировать их. Конформация фактора Vila меняется только после связывания с тканевым фактором и он приобре­ тает способность активировать факторы IX и X [150—154]. Фактор Vila от­ личается от других факторов системы свертывания крови тем, что становит­ ся чувствительным к инактивации антитромбином III только в комплексе с кофактором, что, очевидно, обеспечивает механизм циркуляции свободного фактора Vila в крови [7, 8].

Исследование на модельных системах процесса стимуляции тканевым фактором свертывания крови в условиях, близких к таковым in vivo, позво­ лило установить, что этот процесс можно разделить на фазы: инициация свертывания крови и распространение образования тромбина (см. вклей­ ку, рис. 20).

В первой фазе инициации свертывания крови комплекс тканевый фак­ тор-фактор Vila, называемый теназа внешнего пути, в присутствии ионов кальция влияет на фактор X, превращая его в активную форму. Образую­ щийся при этом в ограниченном количестве фактор Ха генерирует пикомо­ лярные концентрации тромбина.

Первая фаза характеризуется низкой скоростью образования тромбина, частичной активацией тромбоцитов и активацией прокофакторов V и VIII в

125

2.2. Система свертывания крови и ее регуляция

активные кофакторы Va и Villa. В течение этой фазы происходит образова­ ние также пикомолярных количеств факторов Vila, IXa, Ха и Х1а.

Преобразование фактора IX в активную форму также катализируется фактором Ха. Такой путь называется альтернативным, усиливающим меха­ низм активации системы свертывания крови, который ведет к появлению небольшого количества тромбина, необходимого для активации клеточного гемостаза, но недостаточного для процесса фибринообразования.

Кроме активации сериновых протеиназ системы свертывания крови, усиливающий механизм включает образование активной формы фактора VIII, выполняющего кофакторную функцию в тройном энзиматическом комплексе: фосфолипидная поверхность-фактор Villa-фактор IXa [18]. На поверхности мембран тромбоцитов, эндотелия и других клеток фактор IXa образует комплекс с фактором Villa, который эффективно активирует фак­ тор X со скоростью, в 50—100 раз большей скорости активации этого про­ фермента комплексом тканевый фактор-фактор Vila, и тем самым обеспе­ чивает образование тромбина в концентрации, достаточной для остановки кровотечения [158—160].

Продолжительность фазы инициации, которая соответствует времени свертывания крови, зависит, в первую очередь, от концентрации тканевого фактора и ингибитора пути тканевого фактора [161].

Затем при нормальных концентрациях всех прокоагулянтных белков наступает фаза распространения образования тромбина. При свертывании цельной крови образование сгустка происходит в начале этой фазы. Отличи­ тельными чертами фазы распространения является высокая скорость про­ цесса превращения протромбина в тромбин, завершение активации тромбо­ цитов и образование прочного сгустка. Эта фаза регулируется прежде всего AT III и системой протеина С, а также белками семейства серпинов [32, 33, 127, 129, 151, 157].

Образование тромбина в процессе фазы распространения резко снижает­ ся в отсутствие факторов VIII и IX (гемофилия соответственно А и В) и при снижении содержания тромбоцитов до 5 % нормы [2].

Таким образом, активация фактора X может происходить при участии разных компонентов: теназы внешнего пути свертывания крови (комплекса тканевого фактора, фактора Vila и Са2+), теназы внутреннего пути свертыва­ ния крови (комплекса факторов IXa, Villa, фосфолипидов и Са2+). Внутрен­ ний и внешний путь активации системы свертывания крови объединяются на этапе образования протромбиназного комплекса (фактор Xa-Va-фосфо- липидная поверхность), который превращает профермент протромбин в ак­ тивный фермент тромбин [15, 18, 155, 162]. Распределение процессов свер­ тывания крови на внутренний и внешний пути условно, поскольку сущест­ вуют механизмы взаиморегуляции. Так, при незначительном повреждении сосудистой стенки тканевый фактор в комплексе с фактором Vila активиру­ ет фактор IX.

Превращение протромбина в тромбин — быстротекущий процесс, кото­ рый осуществляется in vivo специфическим активатором протромбина — фактором Ха (рис. 2.13). Активация протромбина фактором Ха приобретает

127

2.2. Система свертывания крови и ее регуляция

Трехиепочечная форма молекулы тромбина (у-тромбин) теряет свертываю­ щую способность. Таким образом, расщепление протромбина под действи­ ем тромбина вызывает снижение потенциала системы свертывания крови и является регуляторным процессом по принципу обратной связи.

Генерация тромбина может осуществляться при воспалительных про­ цессах на поверхности активированных моноцитов механизмом, не завися­ щим от фактора VII системы свертывания крови и тканевого фактора. Акти­ вация моноцитов приводит к экспонированию на их поверхности адгезив­ ных белков, в том числе интегринов аМ[32, называемых также Мас-1 или CD11 b/CD 18, принадлежащих к семейству р2-интегринов, которые наряду с другими белками связывают фактор X системы свертывания крови. Катеп­ син G, высвобождающийся из активированных лейкоцитов, вызывает огра­ ниченный протеолиз фактора X, превращая его в активную форму Ха, спо­ собную активировать протромбин в тромбин.

2.2.2. Структура и регуляторные функции тромбина

Тромбин — мультифункциональная сериновая протеиназа (КФ 3.4.21.5) состоит из двух цепей А и В, которые соединены двумя дисуль­ фидными связями. A-цепь состоит из 49 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 259 аминокислотных остатков и стабилизирована тремя дисульфид­ ными связями. Углеводный остаток В-цепи составляет 4—5 % массы фер­ мента и состоит из 3,5 % нейтральных сахаров, 2,6 % глюкозамина и 1,5 % сиаловой кислоты. В-цепь содержит сериновый и гистидиновый радикалы активного центра. Установлено, что после восстановления межцепочечного дисульфидного мостика А- и В-цепи тромбина образуют нековалентный комплекс. A-цепь содержит Са2+-связывающий участок, который стабили­ зирует нативную конформацию молекулы тромбина, играет определенную роль во взаимодействии с липидами, однако не влияет на специфичность действия фермента [160, 170].

Тромбин является одним из главных биорегуляторов системы свертыва­ ния крови, проявляющих специфические протеолитические и гормоноподоб­ ные функции. Он участвует во многих физиологических и патологических процессах, таких как свертывание крови и противосвертывающие механиз­ мы, тромбообразование и фибринолиз, регуляция сосудистого тонуса и про­ цессов развития организма, а также в процессах воспаления, репарации тка­ ней, атерогенеза, канцерогенеза. Тромбин стимулирует клетки, принимаю­ щие участие в этих процессах, в том числе моноциты, Т-лимфоциты, фибро­ бласты, тучные и нервные клетки. На поверхности фибробластов тромбин имеет митогенный эффект; на макрофагах — хемотаксис; на эндотелиаль­ ных клетках — пролиферацию [171 — 178].

Прокоагулянтные свойства тромбина проявляются в реакциях, направ­ ленных на активацию и высвобождение факторов, участвующих в процессе свертывания крови; он индуцирует адгезию тромбоцитов и лейкоцитов к стенке сосуда и взаимодействует с тромбиновыми рецепторами на тромбо-