Вирус Эпштейн-Барр (ebv)

Большое количество людей являются носителями этого вируса. В странах Африки вирус вызывает лимфому Берклита, в европе – инфекционный мононуклеоз. Инфекция носит персистентный характер. Вирус находится в клетках в виде плазмиды. Численность плазмид строго контролируется. "Полная гармония с клеткой в S-фазе".

Способы воспроизведения:

а)плазмидная репликация

б)литическая репликация

Плазмидная репликация.

Осуществляется по схеме Кернса. Большинство генов репрессировано, экспрессируется небольшая часть (причем в разных клетках эти группы отличаются составом). В репликации плазмиды участвует один вирусный белок – EBNA-1 (Epshtein-Barr Nuclear Antigen).

Инициация репликации происходит на участке, называемом oriP (plasmid ori). Его длина около 1700 п.о, внутри на расстоянии 1000 п.н. друг от друга расположены два участка DS (Diad Symmetry) и FR (Family of Repeats).

FR 1000 п.н. DS

4 3

2 1

21. п.н. 21п.н.

33 п.н.

DS состоит из четырех элементов, связывающих EBNA-1.

FR состоит из 20 прямых повторов длиной по 30 п.о. Каждый содержит сайт связывания EBNA-1 (есть предположение, что это нужно для титрации белка).

Остальные белки, участвующие в репликации – клеточные. Каждая плазмида делится только один раз за клеточный цикл и дочерние клетки получают по одной копии.

ORC (Origin Recognition Complex). С помощью EBNA-1 узнает и связывается с oriP в районе DS. Остается связанным с плазмидой в течение всего цикла репликации.

CDC6 – loader хеликазы. Сdt1 – регулирует активность CDC6. Оба белка присоединяются к ORC в G1фазе. Далее загружается гексамер хеликазы MCM. В S-фазе к расплетенному участку ДНК присоединяется ДНК полимераза α/праймаза.

Контроль количества плазмиды осуществляется CDC6 и Cdt1. CDC6 гиперфосфорилируется в S-фазе и экспортируется из ядра в цитозоль, где разрушается протеасомой. Cdt1 ингибируется геминином. В отсутствие CDC6 и Cdt1

Контроль над распределением плазмид между дочерними клетками осуществляет EBNA-1, связывающийся с участком FR.

Литическая репликация.

Другой ori – Orilyt. Плохо изучена.

В репликации принимает участие множество вирусных белков, однако, отсутствует аналог UL9. Неясно как происходит узнавание участка ori, но известно, что ori фланкирован участками для связывания транскрипционных факторов, поэтому, возможно, для инициации репликации необходима транскрипция района ori.

Репликация т-четных и т-нечетных фагов

Репликация с участием конкатемерных молекул. Инициация репликации внутренняя.

Фаг Т7.

Геном 40 000 п.н. на

к

L

R

онцах прямые повторы 160 п.н.

Особенность фага в том, что гены организованы в оперон и транскрипция идет в одном направлении. Левая часть (обозначена как 1) траскрибируется клеточной полимеразой, правая (большая) – вирусной.

160 1 1,1А

1,1В

Причина в том, что фаг вводит ДНК в клетку в две стадии. На первой стадии вводится небольшой участок ДНК, который транскрибируется клеточной РНК-полимеразой. С этих траскриптов синтезируются фаговые белки, которые способствуют вхождению в клетку остальной части ДНК.

1,1 А и 1,1 В – промоторы генов, здесь же находится ori. Это необычный участок, когда РНК-полимераза открывает промотор, она синтезирует РНК длиной 10 п.н. и сваливается. Структура участка такова, что гетеродуплекс РНК-ДНК стабильнее, чем ДНК-ДНК, поэтому РНК остается и служит затравкой для вирусной ДНК-полимеразы. Но репликация вирусной ДНК двусторонняя, откуда взять вторую затравку?

ДНК полимераза Т7. Продукт гена V. Масса 84 кДа. Помимо полимеразной активности обладает рибонуклеозидредуктазной. Фактором процессивности служит клеточный тиоредоксин (!), фаговый тиоредоксин в репликации не участвует. Если домен, связывающий тиоредоксин вставить в ДНКазу I, то процессивность этого фермента в присутствии тиоредоксина увеличивается. Объяснение (не от лектора!): тиоредоксин индуцирует конформационные изменения в молекуле полимеразы, в результате которых полипептидная цепь крепче обхватывает ДНК и в таком состоянии ей труднее соскочить с ДНК.

Отступление: измерение процессивности полимеразы: в качестве матрицы используют меченую одноцепочечную ДНК затем реакционную смесь разводят немеченной матрицей, продукты разделяют электрофорезом и следят за подвижностью меченой ДНК. Если фермент непроцессивный – подвижность фрагмента большая, если процессивный – низкая из-за наличия длинной второй цепи ДНК.

Хеликаза (5'-3')/праймаза. Продукт гена IV. Способен к олигомеризации, образует гексамеры и стабильный комплекс с полимеразой (разведение реакционной смеси не влияет на процессивность и длину фрагментов Оказаки). Затруднение в том, что праймаза движется в одном направлении, а хеликаза – в другом. Объяснение – модель трубы. Существует также предположение, что при этом одни субъединицы гексамера могут работать как праймаза, другие как хеликаза. "Трубу " наблюдали в микроскоп!

Ген IV имеет два промотора. С одного синтезируется полный продукт, с другого – белок с укороченным N-концом, этот укороченный продукт обладает только хеликазной активностью.

Клеточные праймазы имеют довольно широкую специфичность, вирусная же имеет еще более широкую специфичность (на грани с неспецифичностью).