Лекции / 10

Лекция 10

ТЕМА III

Репликация и транскрипция геномов РНК-содержащих вирусов.

Возможные способы репликации РНК-содержащих вирусов.

1. 2)

+Р ±Р

+Р -Р

3) 4)

-Р +Р

±Р +Р

Первый способ репликации РНК-содержащих вирусов.

По этой схеме реплицируются РНК-содержащие бактериофаги: Qβ, MS 12, М17.

Размер генома колеблется от 3400 до 4300 нт.

+Р -Р

Фаг Q_β.

Репликаза Qβ. Фермент способен осуществлять синтез инфекционных + цепей в присутствии матрицы и dNTP. Репликаза способна синтезировать (+)РНК, (-)РНК, низкомолекулярные реплицирующиеся РНК (<100 нт, обнаруживаются в клетках, пораженных фагом). Специфична к матрице, содержащей на 3'-конце последовательность 5'-ССССА-3'. Попытки использовать репликазу для амплификации РНК, закончились неудачей: на (+)РНК с искусственно пришитой последовательностью синтезировалась (-)РНК и на этом амплификация останавливалась. Способна удлинять затравку.

В Пущино в лаборатории Четверина было показано, что репликаза может инициировать синтез РНК без G, но с низкой эффективностью.

Структура репликазы Qβ. Образована из 4 субъединиц 3 клеточных и одной вирусной: α – белок малой субчастицы рибосомы - S1, β – вирусный белок, γ и δ – клеточные факторы элонгации трансляции – Tu и Ts соответственно.

В репликазе S1 имеет иную конформацию нежели в рибосоме и в составе фермента он узнает два участка на РНК: один из них находится в начале гена белка оболочки, другой – внутри гена субъединицы репликазы.

Только этих четырех белков недостаточно для использования полимеразой в качестве матрицы (+) цепи, на 3’-конце которой недоступен из-за того, что он спрятан в структуре типа псевдоузла. Нужен еще один клеточный белок– host factor (HF). Это мелкий белок массой 12 кДа, ассоциированный с рибосомами, является АТФ-зависимым РНК шапероном, также повышающим стабильность РНК. В отличие от субъединиц полимеразы нужных в «каталитических» количествах он требуется в стехиометрических с РНК количествах. HF делает доступным для полимеразы 3’-конец РНК (+)цепи, разрушая псевдоузел. Можно получить мутанта E.coli по HF, тогда в таких клетках могут размножаться только те фаги Qβ, которые не имеют на 3’-конце псевдоузла. В таких мутантах размножаются хорошо другие фаги, что говорит о том, что не всем вирусам для репликации нужен HF.

Таким образом, (+) и (-) цепи узнаются разными наборами субъединиц, если для синтеза (+)цепи на матрице (-)цепи HF, а также S1 не требуются, то для синтеза (-)цепи на матрице (+)цепи нужны все пять белков (α, β, γ, δ и HF). Также надо отметить, что клеточные белки обусловливают специфичность взаимодействия фермента с матрицей.

Функция фактора Tu в трансляции – доставка aatRNA в а-сайт рибосомы в форме связанной с GTP.Фактор Ts служит обменником гуаниловых нуклеотидов для фактора Tu. Каковы же функции факторов элонгации в составе репликазы Q_β ?

Инициация репликации.

Репликаза начинает синтез РНК с G на последовательности СССA, при этом игнорируется 3’-концевой А. По окончании синтеза полимераза нематричным способом включает в цепь А. Так происходит при синтезе как (+), так и (-) цепи, в любом случае синтез начинается с G. Среди клеточных тРНК только у гистидиновой имеется такой же 3’-конец, но из-за прочной структуры – это плохая матрица для фермента.

5’-G-G-G---------------------------------------C-C-C-A-3’ (+)

3’-A-C-C-C---------------------------------------G-G-G-5’ (–)

Можно предположить, что фактор Tu служит для доставки GTP в активный центр репликазы. Кроме того, на 3’-конце (+) и (–) РНК обнаруживается тРНК подобная структура, и, возможно, связывание Tu с ней способствует инициации репликации. Однако, инактивация GTP-связывающего домена алкилированием и блокирование тРНК-связывающего домена пришивкой к нему тРНК не влияет на функционирование репликазы. Видимо, фактор Tu играет структурную роль в составе фермента. Что касается фактора Ts, то получены мутанты, у которых идет трансляция, но подавлена репликация вируса.

На 5’-конец репликаза нематрично добавляет остаток А, процесс специфичен и на укороченные РНК А не добавляется. Может есть внутренние сигналы? Этот А можно удалить, такая РНК становится слабой матрицей и у нее снижается инфекционность.

Элонгация репликации.

Система репликации фага Qβ, состоящая из РНК и репликазы уникальна. Во время репликации цепей любой полярности не образуется дуплексов РНК. Хотя РНК выделяется в виде дуплексов – это артефакт, следствие депротеинизации. Дуплексы могут образоваться при репликации чужой РНК. Что препятствует образованию дуплекса РНК? Во-первых, РНК фага Qβ обогащена участками способными образовывать вторичные структуры и, возможно, при синтезе быстрее образуются внутренние структуры нежели межцепочечный дуплекс. Наиболее выраженной вторичной структурой обладают вироидные РНК. Если их заставить реплицироваться, вставив СССА, то все равно идет образование дуплекса.

Нужен дополнительный механизм для предотвращения образования дуплекса. Гипотеза Четверина. Есть топологическое ограничение для образования дуплекса. Концы РНК комплементарны, поэтому она может нековалентно замкнуться в структуру типа сковородки. Кроме этого, репликаза во время синтеза держится за 5’-конец и дочерняя цепь выпетлевывается.

Трудность в том, что нужно сканировать и концы, для этого их надо расплести, а тогда вся структура развалится. Все можно объяснить с помощью образования РНП, в которых белки препятствуют образованию дуплекса, но синтез идет также и in vitro, где отсутствуют другие белки кроме репликазы.

Еще одна проблема, каким образом преимущественно образуются (+) цепи РНК? In vitro соотношение (+) и (-) цепей можно менять изменяя концентрацию HF, если его много, то много (?), если его мало, то увеличиваетя количество (+) цепей.

Способы вывода (+) цепи из репликативного цикла in vivo:

1)упаковка в капсид;

2)трансляция.

Однажды было обнаружено, что репликаза могла синтезировать нематрично цепи РНК и потом их амплифицировать. Эта РНК была похожа на те низкомолекулярные РНК, которые обнаруживались в клетках, пораженных фагом. Потом Четверин показал, что это загрязнение – РНК летает по воздуху. Если чашку Петри с агаром, содержащим репликазу и субстраты для синтеза РНК и оставить открытой на воздухе, то на агаре появятся колонии РНК. В закрытой же чашке колонии не образуются.

Откуда берутся короткие РНК? Шпигельман (Spigelmann) занимался эволюцией коротких РНК in vitro. В системе in vitro, содержащей РНК фермент и HF при изменении условий инкубации можно получить РНК с разными последовательностями.

Выяснилось, что короткие РНК содержат часть клеточной РНК и часть РНК Qβ, т.е. являются по природе рекомбинантными.

Четверин поставил опыт. Он взял одну из коротких РНК и разделил на две части.

Один кусок мог реплицироваться другой нет. Потом он провел инкубацию обоих фрагментов в агар вместе с репликазой. На агаре появились колонии РНК, содержащей, согласно данным секвенирования, последовательности обоих фрагментов.

3’ 5’

OH

5’ 3’

Процесс напоминает сплайсинг.

Агрессивный 3’OH одной цепи атакует один из нуклеотидов внутри другой цепи. Полагали, что в этом не требуется участия фермента, но без репликазы Qβ процесс идет на несколько порядков медленнее. Механизм не известен. Из образующихся продуктов затем отбираются те, которые способны аплифицироваться репликазой Qβ.