Лекция 3

Ранее мы рассмотрели три группы механизмов репликации вирусной ДНК по способу инициации синтеза ДНК.

1.Образование РНК-затравки на о.ц. ДНК-матрице

а) с помощью РНК полимеразы

б) с помощью праймазы

2.Инициация с внесением разрывов в д.ц. ДНК-матрицу

3.Нуклеотид-белковая затравка

Инициация с образованием внутренней затравки на двуцепочечной днк-матрице без внесения разрывов.

Задача: локально расплести ДНК и посадить хеликазу с праймазой.

Решить эту задачу можно несколькими способами.

Papovaviridae

Papilloma

Polioma

Vacuolating virises (SV 40 (Simian Vacuolating Virus))

Размер генома примерно одинаков: вирусы папилломы – 8 т.п.н., полиомы – 5 т.п.н. Детально мы рассмотрим вирусы полиомы и SV 40.

Хозяева: SV 40 – приматы

Полиомы – мышиные

Место репликации: в ядре, находящемся в S-фазе. SV 40 может переводить клетку в S-фазу клеточного цикла.

Схема репликации: Θ-схема (Cхема Кернса).

Придумана Кернсом 40 л.н для объяснения репликации ДНК E.coli. Было известно, что геном E.coli представлен кольцевой молекулой. Кернс понял, что основной проблемой в ее репликации – устранение топологических препятствий (о сверхспиральности в то время не имели понятия). Он предположил, что должен быть «шарнир», позволяющий вращаться одной цепи ДНК вокруг другой. Сейчас этим «шарниром» мы называем топоизомеру.

У молекулы ДНК, реплицирующейся согласно схеме Кернса, имеется участок, называемый ori.

SV 40.

Геном представлен двуцепочечной кольцевой ДНК. В геноме закодирован белок – большой Т-Ag (80 кДа). Он единственный вирусный белок участвующий в репликации ДНК. Белок полифункционален:

1.способен взаимодействовать с рядом TF (переход клетки в S-фазу)

2.сам является TF (синтез вирусных белков)

3.узнает ori (т.е. отностся к группе белков OBP-Ori Binding Proteins)

4.способен к олигомеризации. В присутствии АТФ и ori образует кольцевой гексамер.

5.обладает хеликазной активностью (3'-5')

Примечание: может неспецифически взаимодействовать с о.ц.ДНК.

С

Ori находится в условном положении 0,67

труктура ori SV 40.

21 22 22

L

L

E

III II I

Pu/Py ORE A/T

CORE

Е

0, 67

ori состоит из трех участков. В этих находятся пентануклеотидные последовательности GAGGC ( ), узнаваемые T-Ag. В III участке находятся повторы 21, 22 п.н.

Во II втором участке находится ORE (Ori Recognition Element), с которым связывается T-Ag, он входит в состав CORE (Core Ori Recognition Element) длиной 64 п.н., и фланкирован c одной стороны А/Т богатым участком, с другой - Pu/Py последовательностью. Общая длина ori со всеми прилегающими участками – 170 п.н.

Сила взаимодействия T-Ag с ORE зависит от степени его фосфорилирования.

Инициация репликации SV 40.

В области ori рядом друг с другом связываются два гексамера T-Ag (при этом форма гексамеров такова, что в электронном микроскопе видно, будто каждый состоит из двух колец) и фиксируют участок ДНК. Затем гексамеры поворачиваются друг относительно друга гидролизуя при этом АТФ. В результате меняется размер внутреннего канала, что сопровождается плавлением участка ДНК между ними. Поскольку гексамеры остаются связанными, происходит выпетлевывание ДНК.

Далее T-Ag проявляет хеликазную активность (3'-5') и расплетает область Ori. На о.ц. ДНК тут же садятся олигомеры RPA (Replicating protein A, аналог SSB E.coli). Затем с расплетенным участком связывается ДНКpolα/праймаза. В комплексе устанавливается физическое взаимодействие T-Ag с RPA и ДНКpolα. ДНКpolα синтезирует РНК-ДНК затравку: короткий олигорибонуклеотид (10 нт) и короткий олигодезоксирибонуклеотид (~20 нт).

T-Ag специфически узнает клеточные белки RPA и ДНКpolα только приматов. Этим и ограничен круг хозяев SV40.

Примечание: внешние факторы, определяющие хозяева вирусов – белки оболочки, в данном случае мы встречаемся с внутренними факторами.

В комплекс входят также клеточная топоизомераза I, устраняющая топологические проблемы (также взаимодействует с Т-Ag) и протеинфосфатаза, регулирующая степень фосфорилированности T-Ag.

Примечание: ДНК SV40 упакована в нуклеосомы (около 20 нуклеосом), т.е. представляет собой минихромосому. Одна из нуклеосом позиционирована на ori и делает его недоступным для взаимодействия с T-Ag. Освобождают ori клеточные комплексы ремоделирования.

Инициация репликации у вирусов полиомы.

Все в принципе то же самое отличие в том, что вместо пентануклеотидных повторов в ori находятся гексануклеотидные и их положение немного отличается.

Элонгация репликации SV40.

ДНКpolα непроцессивный фермент, не обладающий 3'-5' экзонуклеазной активностью (proofreading activity), поэтому часто ошибается и часто соскакивает с ДНК. Она далее замещается на высокопроцессивный фермент ДНКpolδ. Репликация двусторонняя (хотя есть случаи односторонней репликации). Считается, гексамеры T-Ag закреплены на ядерных структурах, поэтому ДНК протаскивается через них.

Примечание: при репликации ДНК одна из синтезируемых цепей является "лидирующей", она синтезируется непрерывно, другая цепь называется отстающей, поскольку синтезируется фрагментами. Полимераза должна уметь делать все, при этом оставаясь связанной с T-Ag. Тогда получается, что T-Ag, связанный с 3'-5' цепью, физически движется в противоположную сторону относительно ДНКpolα, находящейся на 5'-3' цепи.

Умозрительное объяснение этого факта – модель "трубы".

5'

3'

5'

3'

В результате работы комплекса, включающего T-Ag и полимеразы, образуется репликативный " глазок ". По мере появления на 5'-3' цепи участков, на которых возможен синтез

затравки, ДНКpolα делает затравку. Синтезировав короткий кусок, она сваливается и на ее место загружается ДНКpolδ.

5'

3'

3'

5'

Для высокопроцессивной работы ДНКpolδ нужен PCNA, фактор увеличивающий процессивность полимеразы. Иначе его называют clamp («скрепка»). Фактор является гетеротримером и загружается на ДНК с помощью комплекса RF-C (), называемого clamp-loader. Лучше всего PCNA загружается на границе о.ц и д.ц. ДНК.

Соединение фрагментов Оказаки.

Может участвовать РНКазаН, но здесь, видимо, работает иной механизм с участием эндонуклеазы FEN (Flap(фартук) ENdonuclease).

FEN

ДНКpolδ вытесняет кусок длиной около 30нт, который откусывает FEN. ДНКpolδ достраивает брешь, RF-C снимает clamp и полимераза отваливается. Клеточная лигаза зашивает разрыв.

Pol, лигаза