Лекция 8

На прошлой лекции мы рассмотрели функции Е1А белка SV40.

Следующая группа белков – Е4. Часть представителей этой группы образуется путем альтернативного сплайсинга. Взаимодействуют с Rb-белками, высвобождая E2F транскрипционные факторы. Кроме этого, Е4 белки обеспечивают кооперативность взаимодействия E2F факторов с регуляторными элементами ДНК, как это показано на рис.

Рис. Кооперативность взаимодействия E2F-факторов при участии вирусных белков

Регуляция транскрипции на уровне терминации.

Оказывается, что главный поздний промотор работает и на ранних стадиях инфекции, однако полноценных транскриптов не образуется, потому что синтез мРНК обрывается на стоп-сигналах, находящихся недалеко от старта.

Е2 группа генов. Кодируют полимеразу, терминальный белок. Имеется два промотора. Один находится в выключенном сотоянии, другой – работает. Механизм переключения неясен.

Содержит также гены, траскрибируемые РНК полимеразой III класса – VA гены (Virus Associated). Продукты их транскрипции – короткие РНК, содержащие шпильки. Эти РНК блокируют интерферон-индуцируемую РНКазу.

Это пример регуляции экспрессии вирусных генов на уровне трансляции.

Транскрипция SV40 происходит в ядре, при этом не в случайных, а в определенных местах. Там образуются структуры, называемые PML-структурами (promega leicemia).

Использование аденовирусов в генной терапии.

Используются не реплицирующиеся векторы, предназначенные для унижтожения дефектных клеток (например, с помощью подавления активности антиапоптических белков) или для экспрессии белков, необходимых для нормального функционирования клеток, которые по-каким либо причинам клетка сама не может синтезировать.

Отступление: работа в этом направлении затормозилась из-за гибели одного из пациентов. Может быть причиной стала передозировка препарата.

Вирус герпеса.

Весь геном вируса транскрибируется клеточной РНК-полимеразой II. Транскрипция осуществляется в ядерных структурах – PML. Показана временная регуляция экспрессии генов. Продукты экспрессии делятся на α-, β- и γ-белки.

α-белки.

Эксперимент. Чтобы выяснить являются ли данные белки истинно ранними, инфицируют клетки, у которых подавлена трансляция. Если интересующие нас белки не образуются, значит они истинно ранние.

Вместе с вирусной ДНК в клетку вносится регулятор транскрипции ранних генов. Это один из γ-белков, называемый α-TIF (Trans Inducing Factor) или по другой номенклатуре VP16. α-TIF обладает ДНК-связывающей активностью и узнает регуляторный элемент класса UAS (Upstream Activating Sequence), находящуюся перед промотором: TAATGARAT. Для транспорта в ядро фактору необходимо связаться с клеточным белком HCF (часть вирусных белков имеет NLS последовательности). Взаимодействие с ДНК происходит в комплексе с клеточным фактором транскрипции Oct1. В результате, с UAS-элементом связывается белковый комплекс.

Oct1 HCF α-TIF

TAATGARAT

TATA

100 п.н.

Активация транскрипции происходит в том случае, если расстояние от UAS до ТАТА-бокса не превышает 100 п.н.

Белки, кодируемые ранними генами.

ICP0. Не обладает ДНК-связывающей активностью, но регулирует транскрипцию путем связывания клеточных транскрипционных факторов, например, рекрутирует к промотору TFIID. Обладает убиквитинлигазной активностью, неясно зачем.

ICP4. Обладает ДНК-связывающей активностью и может взаимодействовать с клеточными транскрипционными факторами. Способствует высвобождению E2F из комплекса с Rb. Необходим для транскрипции всех средних и поздних генов.

ICP27. Активирует транскрипцию поздних генов, содержащих АТ-богатые элементы со вставкой G. Является также посттрансляционным регулятором экспрессии вирусных генов на этапах полиаденилирования, сплайсинга и транспорта мРНК из ядра.

ICP22 (UL13). Обладает киназной активностью и способен фосфорилировать CTD-домен РНК полимеразы II. Вместе с ним фосфорилировать полимеразу могут клеточные базовые транскрипционные факторы TFIIE и TFIIH.

В активации транскрипции участвует также клеточная топоизомераза.

Эксперимент: на клетках человека, пораженных вирусом CMV (Cytomegalovirus) был проведен первый эксперимент по изучению глобальной экспрессии генов с использованием метода microarray. Определялось изменение содержания мРНК около 6600 человеческих генов. Выяснилось, что изменение профиля транскрипции происходит уже при контакте вируса с поверхностью клетки. Во время инфекции снижается количество мРНК генов регуляторов клеточного цикла, также тубулина и актина, увеличивается экспрессия генов цитокинов, белков теплового шока, интерферона, субъединиц протеасомы, киназ, транскрипционных факторов.

Примечание: введение метода microarray не позволяет решить многие старые проблемы, а переводит эти проблемы на новый уровень.

Транскрипционная активность гена зависит не только от UAS и TF.

Опыт: экспрессия β-глобинового гена, вставленного в геном вируса, регулировалась как у вирусного β-гена.

Латентная вирусная инфекция.