Транскрипция ДНК-геномов вирусов

Лекция 6

Механизмы синтеза РНК довольно консервативны и однообразны среди вирусов. На двуцепочечной ДНК-матрице ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует цепь РНК, вытесняемую из дуплекса ДНК.

Большое разнообразие наблюдается в механизмах регуляции процесса транскрипции.

Для чего нужна регуляция транскрипции?

1.на разных стадиях цикла репродукции требуются разные белки.

2.белки нужны в разных количествах (надо мног структурных белков и мало каталитических).

3.белки ранних стадий могут подавлять активность белков поздних стадий.

Уровни регуляции экспрессии генов:

1.транскрипционный

2.посттранскрипционный (чаще трансляционный)

Мы уделим большее внимание транскрипциоонному уровню регуляции экспрессии вирусных генов.

Белки вирусов условно делят на:

1.ранние (истинно ранние).

2.средние (отсроченно ранние).

3.поздние.

t

Принципы регуляции транскрипции:

1.Системность. Отдельным механизмом регуляции транскрипции контролируется экспрессия группы генов.

2.Каскадность. Включение экспрессии одних генов связано с репрессией или активацией других генов.

Выход продукта экспрессии гена:

1.частоты инициации транскрипции

2.длины гена (расстояние от старта до стопа)

Как правило, регулируемыми стадиями транскрипции являются инициация и терминация.

Регуляция транскрипции прокариот и у эукариот отличается, при этом отличия связаны также с особенностями трансляции. У прокариот мРНК полицистронна, поэтому есть возможность внутренней инициации транснляции. У эукариот мРНК, как правило, моноцистронна, зато существует сплайсинг, позволяющий из одной формы мРНК генерировать множество форм. Сплайсинг считают функциональным аналогом оперонной организации мРНК прокариот.

Рассмотрение механизмов регуляции транскрипции мы начнем с фагов (фактически с прокариотических систем) и потом перейдем к системам вирусов эукариот.

Фаги

Инициация транскрипции. Увеличению частоты инициации способствует сильный промотор. За узнавание промотора у прокариот отвечает σ-субъединица РНК полимеразы.

-35 -10 +1

Промотор РНК-полимеразы включает в себя консенсусные элементы находящиеся вблизи –10 и –35 п.н. Эти элементы отличаются по сродству к σ-субъединице и чем выше аффинность связывания, тем выше сила промотора. Однако, "объятия" должны быть не слишком сильными. Существуют также регуляторные белки – транскрипционные факторы, привлекающие РНК-полимеразу к нужному участку ДНК, фактически создавая "промотор". Существуют репрессоры, блокирующие взаимодействие фермента с промоторами генов.

Таким образом на стадии инициации транскрипции в регуляции важна структура промотора и регуляторные белки.

Терминация транскрипции.

1.ρ-зависимая.

2.ρ-независимая.

ρ- это олигомерный белок, гексамер,

функционирующий как РНК-ДНК хеликаза (5'-3').

С

GC-rich

U-rich

корость элонгации непостоянна, что зависит от структуры матрицы ДНК и РНК и возможны паузы (остановки), на некоторых участках. В течение этих пауз происходит вероятностный выбор между терминацией синтеза и продолжением процесса. В случае мРНК известна структура некоторый сигналов остановок РНК полимеразы.

Комбинацией промоторов и терминаторов различной силы можно регулировать количество синтезируемой мРНК, а, значит, и количество белка.

Фаги с одноцепочечной кольцевой ДНК.

межгенный нетранскрибируемый участок

Две транскрипционные единицы.

Структура транскрипционной единицы.

p II p V p VII p IX p VIII t

мРНК

Вероятность образования короткой мРНК гена VIII, выше, чем длинной мРНК гена II. Соответственно, белка II будет больше, чем VIII. Отсутствует временная регуляция, создается пропорциональное количество белков.

Ps - strong promoter

Pw - weak promoter

ρ_d - ρ-dependent terminator

- several stops

Pw Ps

III VI I IV

ρ_d

Перед I отсутствует промотор и его транскрипция возможна лишь в том случае если преодолевается ρ-зависимый терминатор. Очевидно, что вероятность этого события мала поэтому образуется очень малое количестов мРНК и, соответственно, белка I.

Временная регуляция экспрессии генов фага λ

Карта-схема некоторых элементов генома фага λ.

Nu1 A – J att xis CIII N rex CI cro CII O P Q S R

t_L1ρd P_L P_R t_R1ρd P_O t_R2ρd P_R'

После инфекции клеточная РНК-полимераза узнает 4 промотора: P_L (гена N, левый), P_R (гена CI, правый), P_O (в гене О, левый), P_R' (гена S, правый), но транскрипция идет не со всех промоторов. Терминатор t_R1ρd не очень сильный, поэтому ген CII транскрибируется. Ген cro своего промотора не имеет. t_R2ρd – сильный терминатор, поэтому на нем транскрипция с промотора P_R заканчивается. P_R' – сильный промотор, но через 15-16 н.п. от него находится сильный терминатор, поэтому функциональной мРНК не образуется.

С промотора P_O образуется короткая мРНК длиной 80 н.п. – antisence мРНК, комплементарная мРНК гена CII. В результате действия системы РНК интерференции мРНК CII разрушается и белок не образуется.

Работу промотора P_R стимулирует DnaA.

Важна транскрипция белка N – это белок 12 кДа, выполняющий функцию антитерминатора ρ-зависимой терминации. Мутант по N не жизнеспособен, мутация по ρ супрессирует мутацию по N. Помимо белка для антитерминации необходимо наличие, по-крайней мере, двух мотивов nut (N - utilization). Эти мотивы обнаруживаются в гене N и гене cro, соответственно nut_L и nut_R.

Мотив nut состоит из 8 н.т. box A, 9-10 н.т. – спейсера и несовершенной шпильки в boxB.

Белок N взаимодействует мотивом и меняет его конформацию. Далее на элементе собирается комплекс из клеточных белков, после чего в комплекс привлекается клеточная РНК полимераза.

box A спейсер boxB

В образовавшемся комплексе устанавливается множественные взаимодействия между его компонентами. В итоге РНК-полимераза становится нечувствительной к терминации. nut перекрывается с элементами rut (ρ utilization), обладающими сродством к ρ-фактору. По мере удлинения РНК процессивность РНК-полимеразы увеличивается. Показано, что РНК-полимераза движется быстрее, чем ρ-фактор.

nut | N | NusA | NusG | S 10 | RP

Сам по себе белок N слабо связывается с nut-элементом, в комплексе же стабильность связи увеличивается. Сходный механизм используется для регуляции транскрипции рибосомальных генов.

Начавшаяся транскрипция охватывает гены CIII и СII.

Фаг находится перед выбором:

1.лизогения (активация генов int и cro).

2.литический цикл (активация генов О и Р).

Решение принимается белком II, грубо говоря, если CII много, то – лизогения, если мало, то литический цикл.

Отступление о возникновении наименований CI, CII и CIII. Пораженные фагом клетки могли образовывать мутные колонии, где клетки частично лизировались и прозрачные (англ. clear) колонии, в которых фаг был неактивен. Было установлено, что переход фага в лизогению происходит при мутации в нескольких генах, которых и назвали CI, CII и CIII, от англ. clear.

Как регулируется содержание белка CII?