Общая характеристика бактерий рода BACILLUS

полученной суспензии. Суспензии выдерживают при комнатной температуре,

результаты учитывают через 1 час или 24 часа инкубирования.

Протеаза. Способность бактерий минерализовать белки является таксономическим признаком и определяется по разложению желатина или пептонизации казеина. Тестирование на протеолитическую активность проводят на молочном агаре. Гидролиз желатина изучают на чашках Петри,

которые предварительно заливают голодным агаром, а затем – 25%

мясопептонным желатином.

Амилаза. Для определения амилолитической активности используют крахмальный агар, который после стерилизации разливают в чашки Петри. В

готовую среду уколом наносят исследуемые культуры. Продолжительность культивирования от 3 до 5 дней. Гидролиз крахмала выявляется по зоне просветления вокруг укола, которая четко видна после обработки раствором Люголя.

Липаза. Активность липазы определяют на трибутириновом агаре,

который готовят из расчета 20 гр. на 1 л. воды. После стерилизации среду охлаждают до 800С, добавляют трибутирин и перемешивают на магнитной мешалке в течение 2-3 часов до полной гомогенизации. Затем сразу заливают в чашки Петри. На застывшие агаровые пластинки уколом наносят культуры.

Время инокуляции составляет 5 дней. В результате по зонам просветления судят о липазной активности.

Нитратредуктаза. Восстановить нитраты до нитритов способны микроорганизмы, образующие фермент нитратредуктазу и использующие нитраты в качестве источника азота. В среду засевают клетки исследуемого организма, выдерживают в термостате 7-10 дней. При добавлении реактива Гисса происходит окрашивание клеточной суспензии в красно-розовый цвет за счет того, что в кислой среде в присутствии нитратов и ароматических аминов происходит образование азотистых соединений (Суслова, 2007).

51

Глава 6 Роль микроорганизмов рода Bacillus в биодеградации сложных органических соединений и растворении соединений кремния

6.1Деградация углеводородов бактериями рода Bacillus

Впоследние десятилетия возрос интерес к микроорганизмам -

деструкторам различных высокомолекулярных соединений. Загрязнение окружающей среды нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) является проблемой мирового масштаба и в настоящее время остается одной из сложных и многоплановых в экологии и охране окружающей среды. Разрабатываются различные методы очистки от нефтяных загрязнений: механические, физико-химические,

биологические. В настоящее время подготавливаются микробиологические методы, основанные на использовании ферментативной активности микроорганизмов - деструкторов, использующих высокомолекулярные соединения в качестве единственного источника углерода (Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах, 2004). Микробиологическая деградация ПАУ является основным процессом, приводящим к очистке от этих соединений водоемов и почв. Катаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Bacillus. Бациллы способны полностью утилизировать или частично трансформировать такие соединения, как нафталин, салицилат, ортофталат, октан и др., наряду с псевдомонадами, артробактериями и родококками (Звягинцева, 2001;

Плотникова и др., 2001; Zhuang et al, 2002).

Полициклические ароматические углеводороды - большая группа широко распространенных загрязнителей окружающей среды. Эти соединения обладают мутагенными и канцерогенными свойствами и представляют значительную потенциальную опасность для здоровья человека. Именно поэтому изучение биодеградации, микробного метаболизма и детоксикации

52

этой группы химических соединений привлекло внимание большого количества ученых во многих странах. Углеводороды и аналогичные им битуминозные вещества поступают в водоемы вместе с растительными остатками, а также в виде нефтяных и других промышленных загрязнений

(анионные ПАУ). Распад их в водной массе и донных отложениях возможен лишь при участии микроорганизмов (Андрусенко, 1967)

Как показывают исследования, биодеструкторами различных высокомолекулярных соединений являются бактерии рода Bacillus.

Способность к биодеградации описана для многих штаммов данного рода:

Bacillus naphtovorans (Zhuang et al, 2002), B. benzoevorans, B. gordanae.

Полициклические ароматические углеводороды представляют большой разнообразный класс органических соединений, молекулы которых состоят из трех и более ароматических колец в различных структурных конфигурациях.

Стабильность углеводородов зависит от числа ароматических колец. Например,

в почве молекула фенантрена с тремя кольцами может сохраняться от 16 до 126

дней, в то время когда с пятью - от 229 до 1400 дней (Kanaly et al, 2002).

Нефтяные углеводороды в основном, относятся к парафиновому ряду с прямой,

незамкнутой цепочкой или к нафтеновому с насыщенным водородом циклическим ядром. Анионные ПАУ, как известно, характеризуются выраженным антибактериальным действием и могут вызывать лизис клеток.

Однако некоторые бактерии не только проявляют высокую устойчивость к этим веществам, но и способность разрушать и использовать их. Также известно, что ферменты, участвующие в процессах разложения высокомолекулярных веществ, защищены от температурного воздействия как низких, так и повышенных температур (7, 37 и 500С). Так, например,

большинство штаммов B. stearothermophilus, способных окислять фенол, было изолировано из мест, прогреваемых паротермальными газами (56-580С), в

которых из органических соединений присутствуют фенолы и смолы

(Головачева и др., 1975).

53

Среди основных факторов, влияющих на доступность углеводородов для бактериального окисления, необходимо выделить следующие: относительная растворимость углеводорода в среде, пригодность углеводорода к активному транспорту через клеточную мембрану, отсутствие специфического токсического действия на цитоплазму самого углеводорода или продуктов его окисления, а также наличие у микроорганизмов соответствующей системы ферментов.

Процесс самовосстановления биоценозов, загрязненных нефтью, по мнению большинства исследователей, идет более 10-25 лет. Являясь сложной многокомпонентной системой, нефть доступна для полной утилизации только микроорганизмам, обладающим уникальными ферментными системами.

Пример: экспериментальная работа по биодеградации полициклических ароматических углеводородов, природных компонентов нефти, была проведена для культур Bacillus, выделенных из воды и донных осадков озера Байкал. Было установлено, что «байкальская нефть» представляет собой сложную смесь неразделяемых полициклических углеводородов. Она представлена только высококипящими фракциями и содержит 70,26% углеводородов. В составе последних преобладают насыщенные углеводороды, они составляют 48,14%,

ароматические - 22,12%.

Изучение распространения углеводородокисляющих микроорганизмов показало, что их распространение в исследованном районе пятнистое.

Количество культивируемых углеводородокисляющих микроорганизмов в районе самого нефтяного пятна незначительно - до 100 кл/мл, число гетеротрофов, в основном представленных бактериями рода Bacillus, достигло

300 кл/мл. Возможно, это объясняется токсическим действием нефти на клетки микроорганизмов и сохранением спор бацилл, устойчивых к неблагоприятным условиям. По мере удаления от места нефтепроявления количество нефтеокисляющих бактерий увеличивается от 200 до 1000 кл/мл.

Также установлено, что в поверхностных пробах воды в районе нефтепроявления численность бактерий, разрушающих углеводороды,

54

колеблется от 13 до 2608 кл/мл. В придонных слоях численность возрастает до

20 тыс. кл/мл. Выделенные микроорганизмы были отнесены к родам

Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus и в этой экологической нише бациллы становятся доминирующей группой.

Для пяти штаммов Bacillus, был проведен эксперимент по деградации трех ПАУ (пирена, финантрена и флуорантена). Эти полициклические углеводороды преобладают в твердой фазе аэрозоля, собранного в зимний период.

В результате проведенных исследований установлено, что в присутствии бактерий рода Bacillus, в условиях модельного эксперимента, биодеградация ПАУ составляла 18-30% за исключением штамма № 38 отнесенного к Bacillus sp., где конверсия не превышала 2%, причем фенантрен в данных условиях сохранился полностью (Суслова, 2007).

6.2 Деградация бис-(2-этилгексил)фталата бактериями рода Bacillus

Диэфиры орто-фталевой кислоты (фталаты) - широко распространенные продукты крупнотоннажных химических производств, применяющихся в основном в качестве пластификаторов при изготовлении полимерных материалов.

Начиная с 50-х годов прошлого столетия, производство фталатов в мире непрерывно росло, и в последнее десятилетие достигло уровня миллионов тонн в год. Из нескольких десятков производимых в промышленных масштабах фталатов ведущее место принадлежит бис-(2-этилгексил)фталату (БЭГФ).

БЭГФ является внешним пластификатором и не образует химических связей с полимером, поэтому он способен постепенно мигрировать из пластмасс в окружающую среду. Это соединение отличается термо- и фотостабильностью,

устойчивостью к химическому гидролизу и относительно высокой для гидрофобных веществ растворимостью в воде (до 1 мг/л) (Giam et al, 1984).

55

Пример, для изучения способности чистых культур Bacillus к деградации фталата были взяты пять штаммов микроорганизмов, выделенных из донных осадков Байкала в районе Посольской бани. Два штамма были определены до вида как Bacillus pumilus и B. рolymyxa и три штамма - Bacillus sp.; изучение физиолого-биохимических свойств показало, что все штаммы разные.

Результаты эксперимента показали, что бактерии рода Bacillus более активно деградируют фталаты, чем псевдоманады.

Приведенные исследование показали, что бактерии рода Bacillus,

изолированные из донных осадков озера Байкал, способны эффективно разрушить сложные высокомолекулярные органические вещества. Данные микроорганизмы, несомненно, обладают большим потенциалом в биодеградации органополлютантов, обеспечивая чистоту байкальских вод

(Суслова, 2007).

6.3 Роль представителей рода Bacillus в растворении соединений кремния

Некоторые бактерии и грибы играют важную роль в мобилизации оксида кремния и силикатов в природе. Часть этого микробного участия подтверждается выветриванием горных пород, состоящих из силикатов и алюмосиликатов. Установлена зависимость этого процесса от кристаллохимических особенностей минералов. Действие растворения может включать расщепление структурных связей силоксана Si-O-Si или Al-O, либо удаление катионов из кристаллической решетки силикатов, которые вызывает последующее разрушение. Способ влияния может выражаться: 1 – в

микробиально полученных лигандах для катионов, 2 – в микробиально полученных органических или неорганических кислотах, 3 – в микробиально полученных щелочах (аммиак или амины), 4 – в микробиально полученных внеклеточных полисахаридах, работающих при кислых значениях рН

(гликокаликс).

56

Показано, что микробиально полученные лиганды двухвалентных катионов вызывают растворение кальций-содержащих силикатов.

Полимерные силикаты могут трансформироваться бактериями в мономерные силикаты, как было показано при изучении Proteus mirabilis или

B. сaldoliticus. Культура Proteus способна усваивать некоторые мономерные силикаты. Механизмы деполимеризации не выяснен.

В случае B. сaldoliticus, способность трансформировать силикаты, по видимому, является зависимой от роста, даже учитывая, что организм не накапливает Si. При разрушении кварца деградация полимеров кремния до мономерной стадии, по-видимому, происходит через промежуточное звено олигомерной стадии. Органосиликаты могут также образовываться в качестве промежуточной стадии. Детальные механизмы, посредством которых эти преобразования происходят, не известны. Однако ясно, что эти процессы биодеградации имеют фундаментальную важность в биологическом цикле оксида кремния (Erlich, 1996).

57

Выводы

1.Бактерии рода Bacillus являются убиквистами, то есть распространены повсеместно.

2.Классификация Bacillus еще до конца не изучена и требует дальнейшего исследования.

3.Благодаря способности к спорообразованию, бактерии рода Bacillus могут выживать в экстремальных условиях среды обитания, а также проявлять устойчивость к различным химическим веществам, различным физическим факторам, включая влажный пар, высушивание, ультрафиолетовое и гамма-

излучение, вакуум и окисляющие агенты.

4. Главной средой обитания бактерий, принадлежащих к видам Bacillus,

является почва. Так же клетки бацилл могут составлять до 20% общей численности гетеротрофной микрофлоры морской воды.

5.За исключением сибиреязвенной бациллы, бациллы не обладают большой патогенностью для млекопитающих. Эндоспоры могут сохранятся в почве в течение многих лет. Это делает их опасными для млекопитающих, в частности для человека.

6.Бактрии рода Bacillus рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней растений в силу их широко распространенного природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам.

7.Спорообразующие бактерии обладают биологической активностью таких ферментов как протеаза, амилаза, липаза и др.

8.Установлено, что бактерии рода Bacillus способны разрушать сложные высокомолекулярные органические вещества. Бактерии рода Bacillus активно развиваются в районе нефтепроявлений и активно участвуют в ее биодеградации.

9.По данным литературных источников, исследование бактерий рода Bacillus в

морской среде, их способность изменять свойства в зависимости от характера

58

загрязнения, еще не проводилось. Что, несомненно, вызывает интерес для

дальнейшего изучения данного объекта в морской среде.

59

Список литературы

1. Андрусенко, М. Я. Об окислении углеводородов различными физиологическими группами углеводородокисляющих микроорганизмов / М.

Я. Андрусенко, Б. И. Бильмес // Биология и физиология микроорганизмов: сб.

научн. тр. АН УССР отдел микробиологии. - Ташкент, 1967. - С. 41-45.

2.Аэробные спорообразующие бактерии. Род бациллус (Bacillus) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://molbiol.ru/wiki.

3.Бакулина, Л. Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рада Bacillus и их использование в ветеринарии / Л. Ф.

Бакулина, И. В. Тимофеев, Н. Г. Перминова, А. Ф. Полушкина, Н. И. Печоркина

// Биотехнология. - 2001. - № 2. - С. 48-56.

4.Биологическая роль бактерий [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://mikrobio.ho.ua/mikro-text12.html.

5.Головачева, Р. С. Новый вид термафильных бацилл - Bacillus thermocatenulatus nov. sp. / Р. С. Головачева, Л. Г. Логинова, Т. А. Салихов, А.

А. Колесников, Г. Н. Зайцева // Микробиология. - 1975. Т XLIV - Вып. 2. - С. 265268.

6. Головачева, Р. С. Окисление фенола некоторыми штаммами Bacillus stearothermofillus / Р. С. Головачева, А. Е. Орешкин // Микробиология. - 1975. Т XLIV - Вып. 3. - С. 470-475.

7.Жизнь растений. Энциклопедия в шести томах. Том 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. -кор. АН СССР, проф. Н. А. Красильникова и проф. А. А. Уранова. - М.: Изд. «Просвещение», 1974. - 487 с.

8.Звягинцева, И. С. Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями / И. С. Звягинцева, Э. Г. Суровцева, М. Н. Поглазова, В. С.

Ивойлов, С. С. Беляев // Микробиология. - 2001. - Т. 70, № 3. - С. 321-328.

9.Интернет Учебник Тодора в бактериологии [Электронный ресурс]. –

Режим доступа: http://textbookofbacteriology.net/index.html.

60