Общая характеристика бактерий рода BACILLUS

состоят из чередующихся L- и D-аминокислот, причем наиболее часто встречается последовательность L-аланин/D-глутаминовая кислота/L-

диаминокислота (обычно м-диаминопимелиновая кислота или L-лизин). Если у грамотрицательных бактерий химический состав и структура пептидогликана достаточно однообразны, и, следовательно, имеют небольшую ценность для целей классификации, то у грамположительных бактерий обнаруживается большое разнообразие состава и структуры пептидных цепей, которые могут соединяться поперечными сшивками непосредственно или через межпептидные мостики. Было описано около 100 различных типов пептидогликанов. Поскольку структура и состав пептидогликанов, образуемых различными бактериями, обычно стабильны и не зависят от условий культивирования, то состав клеточной стенки у многих грамположительных бактерий часто служит важным хемотаксономическим признаком.

У большинства видов Bacillus муреин представлен вариантом с пептидами, непосредственно соединенными через мезодиаминопимелиновую кислоту (mDpm или mА2pm) (Харвуд, 1992).

1.3 Строение спор

Поверхность наружной оболочки спор разнообразна у аэробных бактерий: либо гладкая, либо с выростами, выступами и почками. Оболочка составляет значительную часть споры. Основными ее компонентами являются белки (60-90%) и липиды. Состав аминокислот в белках оболочки неодинаков у бактериальных спор разных видов, однако большая часть цистина,

содержащегося в значительном количестве в спорах, обнаруживается именно в оболочке.

11

Рис 1. Схемотическое строение споры:

1 -экзоспориум; 2 -слои споровой оболочки; 3 - внешняя мембрана споры; 4 - кора; 5 - внутренняя мембрана споры; 6 — сердцевина.

Под оболочкой располагается кора споры, состоящая в основном из муреина, который является нерастворимым структурным материалом коры.

В течение многих лет покоящаяся спора рассматривалась как почти инертное тело, обладающее несколькими ферментами или вовсе лишенное их.

Некоторых ферментных систем, имеющихся в вегетативной клетке, например цитохромов и ферментов цикла трикарбоновых кислот, ничтожно мало в споре.

Это указывает на то, что в спорах аэробный энергетический метаболизм осуществляется иным путем, чем в клетках. Аналогичные ферменты спор и вегетативных клеток в спорах более термоустойчивы.

Споры аэробных бактерий обладают различной термоустойчивостью, что обусловлено как видовыми особенностями, так и условиями их образования.

Установлено, что споры, образующиеся при высокой температуре, а также полученные на средах с высоким содержанием кальция, парааминобензойной кислоты и некоторых жирных кислот, более жароустойчивы.

Споры более устойчивы, чем вегетативные клетки, от которых они образовались, к воздействию проникающей радиации, ультразвука,

гидростатического давления, замораживания, разрежения и др. Устойчивость спор к кислотам и щелочам во многом зависит от их принадлежности к различным видам бактерий. Споры некоторых культур бактерий остаются жизнеспособными даже при кипячении в концентрированной соляной кислоте в течение 20 мин. При этом резистентность спор во много раз повышается при

12

их обезвоживании (Жизнь растений. Энциклопедия в шести томах. Том 1.

Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. - кор. АН СССР, проф. Н. А.

Красильникова и проф. А. А. Уранова, 1974).

К спиртам и другим органическим растворителям устойчивость спор намного выше, чем у вегетативных клеток. Споры менее устойчивы к действию алкилирующих агентов. При воздействии комплекса определенных ферментов удается достигнуть растворения спор.

Механизм устойчивости спор к действию высокой температуры,

проникающей радиации и других физико-химических факторов полностью еще не выяснен. Термоустойчивость спор объясняется наличием кальция,

дипиколиновой кислоты и в некоторой степени диаминопимелиновой кислоты.

Эти вещества определяют в значительной мере и резистентность спор к действию радиации. Полагают, что споры содержат комплекс особых веществ,

подобных хелатным соединениям, которые предохраняют жизненно важные структурные элементы от губительного воздействия физико-химических факторов.

Важным фактором, приводящим к образованию спор, является отсутствие для данного вида аэробных бактерий благоприятных условий для роста и развития. Способствует спорообразованию обеднение питательной среды.

У аэробных бактерий анаэробные условия выращивания подавляют как спорообразование, так и рост. Спорообразование аэробных бактерий протекает лишь в условиях доступа кислорода. Интенсивность споруляции подавляется в разной степени при выращивании бактерий в неблагоприятных условиях - при температуре выше оптимальной или реакции среды менее подходящей для обильного развития. Неблагоприятные условия роста, ускоряющие споруляцию бактерий, как правило, не обусловливают обильного «урожая» спор (Жизнь растений. Энциклопедия в шести томах. Том 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. - кор. АН СССР, проф. Н. А. Красильникова и проф. А. А. Уранова, 1974).

13

Разные виды аэробных бактерий отличаются расположением и формой спор. Эти признаки имеют важное систематическое значение. У некоторых видов расположение спор строго определенное - центральное, околоконцевое и концевое. У других видов не наблюдается строгой локализации.

Высокое содержание в питательной среде источников азотного и углеродного питания, обеспечивающих максимальный рост бактерий, может подавлять индукцию спорообразования. Так, потребность в глюкозе - основном энергетическом источнике вегетативного роста аэробных бактерий - является несущественной для спорообразования некоторых видов, а в отдельных случаях она угнетает процесс споруляции. Культуры определенных видов бактерий более интенсивно спорулируют при уменьшении в среде аланина, валина,

лейцина и изолейцина. У других бактерий отсутствие в среде лейцина и серосодержащих аминокислот угнетает спорообразование.

Интенсивность процесса образования спор в значительной мере обусловлена наличием в среде минеральных солей, содержащих ионы кальция,

магния, калия, марганца, железа, цинка, меди и некоторых редких металлов

(кобальта, лития, кадмия, никеля). Оптимальная концентрация минеральных солей и металлов различна в зависимости от вида выращиваемой культуры бактерий, условий ее роста. Роль минеральных солей и отдельных ионов металлов настолько велика, что в их отсутствии спороношение может вовсе не наблюдаться. Изменения концентраций их в питательной среде могут оказать иногда резко различное действие.

Спорообразование отдельных культур бактерий настолько зависит от наличия минимальных концентраций некоторых металлов, что эта особенность используется в аналитических целях.

Роль минеральных солей различных металлов в образовании бактериальных спор установлена недавно, и многие вопросы механизма их действия пока не выяснены. Полагают, что их специфическое действие связано с активированием различных ферментативных систем. Значение таких элементов, как кальций, заключается также и в том, что они способствуют

14

образованию разнообразных низкомолекулярных веществ в спорах,

обеспечивающих их термостабильность.

Сравнительно слабо изучено влияние на образование спор различных витаминов и других ростовых веществ. Некоторое усиление этих процессов отмечено под влиянием парааминобензойной и фолиевой кислот.

В результате всестороннего изучения биохимии спорообразования показано, что при споруляции не образуются новые ферментные системы.

Аналогичные ферменты, обнаруживаемые в вегетативной клетке и споре,

имеют одинаковые молекулярный вес, аминокислотный состав и другие физико-химические свойства. Теплоустойчивость ферментов спор вызвана присутствием в них ионов кальция, марганца и других металлов (Жизнь растений. Энциклопедия в шести томах. Том 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. - кор. АН СССР, проф. Н. А. Красильникова и проф. А. А. Уранова, 1974).

Данные исследований свидетельствуют о том, что природа и функция ферментативного аппарата, осуществляющего синтез белков в споре и материнской вегетативной клетке, одинаковы. Основной системой транспорта электронов в спорах является растворимая флавопротеиноксидаза. При споруляции выявлена высокая активность ряда ферментов, например аргиназы,

некоторых нуклеаз. Основная масса белков споры синтезируется заново в период споруляции. Одновременно отмечается процесс распада белков, причем многими авторами обнаружена тесная взаимосвязь протеолитической активности с функцией спорообразования у бактерий. Из вновь синтезированных белков лишь незначительная часть используется для создания структурных элементов споры. В целом споруляцию можно охарактеризовать как процесс интенсивного распада белков и всех основных типов РНК материнской клетки с одновременным образованием новых белковых компонентов.

Различия в составе белков споры и вегетативной клетки выявляются серологическими методами. По антигенной структуре спорулирующая и

15

аспорогенная формы культур одного и того же вида различны. Не установлено существование какого-либо антигена, общего для спор бактерий разных видов.

Наоборот, по антигенной структуре имеется достаточно отчетливая дифференциация между спорами разных видов.

В способе прорастания споры и продолжительности процесса также отмечается определенное постоянство, характерное для различных видов бактерий.

Старые споры прорастают в течение более длительного периода, чем молодые. Время прорастания молодых спор является довольно постоянным у различных бактерий и может служить видовым признаком. Если перенести только что сформировавшиеся споры в благоприятную питательную среду, то прорастание их начинается не сразу, а по истечении 2-3 ч.

Установлено, что на начальной стадии прорастания спор происходит выделение в среду так называемого экссудата прорастания,

характеризующегося специфическим поглощением ультрафиолетовых лучей.

Вещество это было выделено и идентифицировано как кальциевая соль дипиколиновой кислоты (пиридин - 2,6-дикарбоксиловая кислота).

Дипиколинат кальция составляет приблизительно половину сухой массы экссудата прорастания, что соответствует 15% от общей сухой массы покоящихся спор. Остальная часть экссудата прорастания представлена свободными аминокислотами, высокомолекулярными и низкомолекулярными белковыми веществами. Обнаружено особенно большое количество не диализируемого гексозаминсодержащего пептида с молекулярным весом порядка 10 000, в состав которого входят диаминопимелиновая кислота,

аланин, глютаминовая кислота и гексозамины. Условно это соединение названо ДАП-гексозаминпептид. Это соединение входит в состав оболочки спор, в

отличие от дипиколиновой кислоты, обнаруживаемой внутри спор.

Среди факторов, способствующих процессу прорастания спор, большое внимание уделяется тепловой активации, действие которой более выражено при наличии в среде некоторых химических соединений. Тепловая активация

16

достигается предварительным кипячением суспензии спор при 97-100° C в

течение 10-15 мин или при 65° C в течение 2 ч. Иногда этот эффект достигается при обычной пастеризации. Тепловая активация прорастания спор носит общий характер для разных видов спороносных бактерий, хотя она более специфична для аэробов, чем анаэробных видов. Обычно тепловое воздействие усиливает и ускоряет прорастание спор в течение короткого промежутка времени. Действие подобной обработки спор, как правило, преходяще, хотя при этом отмечается и некоторое изменение условий, необходимых для течения процесса прорастания спор. Так, для лучшего прорастания спор сенного бацилла без предварительной тепловой обработки необходимо присутствие в среде L-аланина, аденозина,

глюкозы и тирозина, тогда как после тепловой обработки оптимальные условия прорастания спор обеспечивают наличие лишь глюкозы и аденозина.

Установлено также, что сохранение в течение длительного времени спор при

37° C после их тепловой активации ведет к деактивации. Тепловая обработка этих спор после длительного хранения вновь ведет к реактивации прорастания.

Имеются данные о некотором активирующем влиянии на прорастание спор умеренного воздействия ультразвука.

Исследования последних лет показали, что интенсивность прорастания спор специфически повышается в присутствии некоторых веществ, в первую очередь L-аланина, пуриновых нуклеозидов и глюкозы. Иногда необходимо наличие, помимо L-аланина, ряда других аминокислот. Из рибозидов наиболее эффективным оказался аденозин.

Аланин является наиболее специфическим активатором процесса прорастания спор из всех известных соединений, обладающих подобным действием.

Оптимальные условия для прорастания спор анаэробных бактерий несколько более сложны, хотя факторы, активирующие процессы прорастания спор аэробных видов, и в этом случае оказывают активирующее действие.

Наряду с активаторами выявлен ряд веществ, угнетающих процесс прорастания спор. Прорастание спор у аэробных видов угнетается в

17

присутствии оксина, некоторых мышьяковистых соединений, углекислого натрия, высоких концентраций ряда аминокислот - глицина, метионина,

цистеина и валина. Характерно угнетающее действие D - аланина в отличие от

L-аланина.

Механизм активирующего и угнетающего действия ряда факторов на прорастание спор остается неясным. Одни авторы приписывают активаторам определенную роль в процессах деполимеризации различных составных элементов в спорах, высвобождении и активации ряда ферментных систем,

обусловливающих начало прорастания спор. Другие считают их энергетически активными соединениями, стимулирующими биохимические процессы в момент прорастания спор.

Обычно не все споры, вносимые в благоприятную среду, прорастают сразу. Некоторое их количество остается не проросшими в течение различного времени, не теряя, однако, своей жизнеспособности. Установлено, что при длительном хранении процент прорастающих спор постепенно снижается.

Причина этого явления и природа подобных «дремлющих» спор остаются неясными.

В покоящейся споре имеются ферментные системы, выявляемые лишь после их активации под влиянием определенных факторов и химических соединений, которые, однако, исключают прорастание спор. К таким системам относятся прежде всего окислительные ферменты. Активация их достигается обработкой спор незначительными количествами L-аланина, аденозина и некоторыми другими веществами, а также кипячением или пастеризацией суспензий спор. Перевод неактивной ферментной системы в активную без признаков прорастания спор считается первым этапом биохимических изменений в спорах, ведущих в дальнейшем к началу процесса их прорастания.

Полагают, что под действием активаторов дипиколиновая кислота,

связывающая окислительные и другие ферменты, подвергается деполимеризации с освобождением ферментных систем.

18

С помощью высокочувствительного микрореспирометра у бактериальных спор установлена дыхательная активность.

При изучении химического состава клеточной стенки спор различных видов аэробных бактерий обнаружены характерные различия в содержании ДАП-

гексозаминпептида и других веществ - полисахаридов, липидов. ДАП-

гексозаминпептид высвобождается из стенки спор под действием литического агента, уподобляемого по своим свойствам лизоциму (Жизнь растений.

Энциклопедия в шести томах. Том 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. - кор. АН СССР, проф. Н. А. Красильникова и проф. А. А. Уранова, 1974).

Стадии споруляции. Бактерии достаточно сложно принять решение о начале споруляции, поскольку этот процесс, будучи запущенным, уже необратим. А поскольку это решение коренным образом меняет метаболизм клетки, ошибка может иметь для нее печальные последствия. Поэтому для принятия этого решения бактерия должна проанализировать множество сигналов от внешней среды от внутриклеточных метаболических систем, от клеточного цикла. Сигналы могут происходить от нехватки питательных веществ, плотности популяции, синтеза ДНК, повреждений ДНК, цикла Кребса

(Hoch,1978).

Споруляция разделяется на семь стадий, различия между которыми основаны на цитологических изменениях, происходящих в процессе образования споры. Стадия 0, являющаяся подготовительной стадией споруляции, наблюдается в конце логарифмической фазы роста, или в период То (Т1, Т2, Т3 и т. д. соответствуют времени, в часах, по отношению к концу логарифмической фазы). В лабораторных условиях процесс споруляции обычно занимает около 6-8 ч, и, таким образом, порядковый номер стадии развития и время, выраженное в часах, почти совпадают: например, стадия IV наблюдается в периоде Т4.

19

Рис 2.Стадии споруляции у В. sublilis. Последовательность событий приведена в направлении по часовой стрелке от начальной стадии 0 в конце логарифмической фазы роста.

На стадии 0 никаких морфологически различимых споруляционных структур нет, и клетки имеют вид, характерный для вегетативной стадии. В

настоящее время на стадии I не идентифицированы какие-либо морфологические изменения, характерные для процесса споруляции; таким образом, можно считать, что развивающиеся клетки переходят от стадии 0 к

стадии II.

Стадия II - это первая стадия споруляции, распознаваемая морфологически. Она характеризуется появлением проспоровой перегородки,

которая асимметрично делит клетку на маленькую проспору и большую материнскую клетку. Это критический шаг, так как образование асимметрично расположенной мембраны является ключевым этапом споруляции.

В течение стадии III материнская клетка поглощает проспору. Проспора,

которая теперь находится в цитоплазме материнской клетки, имеет на периферии двойную мембранную структуру, и молекулы, перемещающиеся из цитоплазмы материнской клетки в цитоплазму проспоры, должны пройти через эту двойную мембрану по следующему пути:

Цитоплазма материнской клетки→ Внешняя мембрана проспоры (изнутри-

наружу)→пространство между мембранами Внутренняя мембрана проспоры (снаружи внутрь) → цитоплазма проспоры

20