Общая характеристика бактерий рода BACILLUS

Внешняя мембрана проспоры имеет ориентацию, противоположную ориентации внутренней мембраны проспоры. Ориентация внешней мембраны проспоры «изнутри - наружу» была продемонстрирована с помощью изолированных проспор, которые могут легко окислять NADH и

гидролизовать ATP, если эти субстраты добавляются в среду.

После поглощения проспоры процесс споруляции становится необратимым, и обогащение среды уже не способно его остановить (Freese et al, 1970).

На стадии IV начинается образование кортекса между внутренней и внешней мембранами проспоры. В это время спора начинает сильно преломлять свет, что хорошо заметно при микроскопировании. Такую спору называют рефрактильной. Развитие кортекса, вероятно, продолжается и на следующей стадии. За стадией IV, в течение стадии V, происходит конденсация белков внутренней споровой оболочки на поверхности внешней мембраны проспоры. Внутренняя оболочка споры представляет собой сложно организованную многослойную структуру.

Внешняя оболочка споры конденсируется на поверхности внутренней оболочки в течение стадии VI. Итак, споровая оболочка - это сложная структура, состоящая из белкового внешнего слоя (внешняя оболочка споры) и

пластинчатого внутреннего слоя (внутренняя оболочка споры). По мере развития споровой оболочки спора становится все более устойчивой к химическим реагентам и нагреванию. Созревание споры происходит на стадии

VI, и за ним, на стадии VII, следует освобождение зрелой споры от материнской клетки.

Были выделены мутанты, у которых блокировалось наступление различных морфологических стадий. Эти мутанты обозначены как spoO, spol, spoIII, spoIV, spoV и spoVI в зависимости от номера последней морфологической стадии развития, которая у них имеет место.

Точное время начала споруляции в лабораторных условиях зависит от штамма Bacillus и используемой среды. Для штамма В. subtilis Marburg на

21

модифицированной среде Шеффера (Leighton et al, 1971). Споруляция инициируется в период То и к периоду Т5 в материнской клетке можно видеть рефрактильные споры. Аналогичная картина споруляции наблюдается, когда клетки переносят с богатой ростовой среды на минимальную среду более определенного состава. Споруляция происходит наиболее синхронно и эффективно, если клетки до инициации споруляции выращивали в богатой среде минимум шесть или семь генераций.

С определенными стадиями споруляции связано появление конкретных ферментов и функций; в настоящее время ясно, что некоторые из этих ферментов не вовлечены непосредственно в споруляционный процесс. Для того чтобы убедиться в этом, были получены делеционные мутанты по генам,

кодирующим такие ферменты, и у этих мутантов изучена способность к споруляции. В случае субтилизина и нейтральной протеазы споруляция не нарушается при полном отсутствии этих ферментов (Kawamura et al, 1984).

Возможно, что не все внеклеточные ферменты, которые синтезируются в процессе споруляции, требуются для этого процесса, хотя их синтез может частично быть под тем же контролем, что и синтез истинных споруляционных продуктов. Все же полезно использовать эти ферменты и их функции как легко идентифицируемые маркеры споруляционного процесса.

22

Глава 2 Места обитания бактерий рода Bacillus

2.1 Почва

Главной средой обитания бактерий, принадлежащих к видам Bacillus,

является почва - штаммы этих бактерий были выделены даже из образцов почвы, взятых в местообитаниях с экстремальными условиями - в пустыне и в Антарктике. Обычно разнообразие бактерий в почвах с низким содержанием органических веществ достаточно ограничено. В них доминируют В. subtilis, В. licheniformis и В. cereus. Однако по мере повышения плодородия почвы разнообразие видов увеличивается.

Особенно успешным для изучения почвенных бактерий в различных почвах было применение метода нумерической таксономии (Goodfellow et al, 1985). Отбирая образцы почвы, следует помнить, что термофильные бактерии,

например, не обязательно обитают только в термальных источниках, а

алкалофильные бактерии - в почвах с высокими значениями рН. Из обычной почвы можно выделить разнообразные штаммы бацилл, способных расти при значениях рН, превышающих 10 (Aunstrup et al, 1972), а клетки В. stearothermophilus могут быть выделены из почв районов с умеренной температурой. В то же время экстремальные термофилы, а также ацидофильные штаммы В. acidocaldarius встречаются исключительно в термальных источниках и окружающих их почвах (Логинова и др., 1978).

Некоторые галоалкалофильные бациллы обитают, скорее всего, исключительно в щелочных соленых озерах. Поэтому бактерии с экстремальными свойствами,

такими как устойчивость к высокой температуре или рН, лучше искать в образцах, взятых в экзотических условиях. Тем не менее, если использовать соответствующие условия обогащения и выделения, то и из обычной почвы также можно выделить большое количество различных таксонов. Об этом говорит и частота выделения новых видов из обычных почв (цитир. Харвуд, 1992).

23

2.2Вода

2.2.1Морская вода

Клетки бацилл могут составлять до 20% общей численности гетеротрофной микрофлоры морской воды. Хотя имеются сообщения о еще более высоких цифрах, но в среднем численность бацилл составляет около 9%.

Более высокая численность бацилл характерна для прибрежных вод, причем она возрастает с увеличением температуры и глубины и уменьшается с удалением от берега. Это, по-видимому, отражает «вымывание» почвенных бактерий в море. Береговое происхождение этих бактерий подтверждается выделением термоактиномицетов из морских течений, эстуариев, прибрежных участков морей и районов открытого моря (Cross, 1981; Attwell, Colwell, 1984).

В морской воде преобладают, по-видимому, клетки В. licheniformis, вторыми по численности идут клетки В. subtilis и, в незагрязненных образцах, В. pumilus. К

другим видам, встречающимся более редко и в основном в незагрязненных районах, относятся В. brevis, В. firmus и В. sphaericus. В морских осадочных отложениях обычно наблюдается большее разнообразие бацилл по сравнению с водной толщей, и процентное содержание их там составляет от 14 до 80%

суммарного количества гетеротрофных бактерий. В этом случае частота встречаемости зависит также от расстояния до берега и от уровня загрязненности: В. subtilis и В. pumilus преобладают в загрязненных прибрежных водах, а в незагрязненных районах встречается еще В. cereus. В

океанических осадках обнаружено большое, разнообразие бацилл; кроме перечисленных видов из них были выделены В. firmus и В. licheniformis (Bonde et al, 1981). Количественные исследования осадков из Северного моря,

проведенные Буайе и Хертцом, показали, что в них преобладают штаммы В. subtilis, В. licheniformis и В. firmus.

Большинство морских штаммов Bacillus, судя по всему, соответствуют стандартным видам и не имеют каких-либо особых признаков. Однако

24

некоторые виды характерны только для этой среды, таковы, в частности,

организмы, близкородственные В. firmus и классифицированные Бонде как штаммы «М» (Bonde, 1981). Другие морские бактерии, такие как «В. epiphytus», «В. filicolonicus» и «В. cirroflagellosus», не имеют определенного таксономического положения (Zobell et al, 1944).

Со штаммами, выделенными из соленых маршей и ила эстуариев,

возникает в настоящее время таксономическая проблема. Колонии этих бактерий часто окрашены в оранжевый, желтый или розовый цвет, вероятно,

они являются вариантами В. firmus и В. lentis. Хотя они были описаны как

«спектр» штаммов, однако недавние исследования методом нумерической таксономии позволили предположить, что они относятся к нескольким отдельным таксонам, родственным В. firmus (Logan, Berkeley, 1981; Priest et al, 1988).

2.2.2 Пресная вода

Бациллы, обнаруживаемые в пресной воде, в основном имеют, вероятно,

почвенное происхождение. Бактерии рода Bacillus встречаются чаще всего в осадках и представляют собой типичные почвенные организмы, такие как В. megaterium, В. cereus, В. firmus и В. pumilus (Allen et al, 1983).

Особый интерес представляют термофильные бациллы, выделенные из горячих источников и других термальных пресных вод. К ним относятся В. acidocaldarius и чаще встречающиеся В. stearothermophilus, «В. thermodenitrificans», В. coagulans и «В. thermocatenulatus» (Головачева и др., 1975; Wolf, Sharp, 1981).

2.3 Животные и человек

За исключением сибиреязвенной бациллы, бациллы не обладают большой патогенностью для млекопитающих. Bacillus cereus вызывает ряд оппортунистических инфекций (осложняющих другие заболевания) - чаще

25

всего мастит у коров, образование абцессов, септицемию, эндокардиты, а также инфекции уха, глаз и ран (Gilbert et al, 1981). Самое распространенное заболевание, вызываемое В. cereus - отравление, связанное с потреблением пищи, большей частью риса, в котором размножились клетки токсикогенных штаммов В. cereus. Штаммы В. cereus выделяют два токсина - рвотный и диаррейный, вызывающие симптомы отравления.

Диаррейный тип интоксикации связан, по-видимому, с употреблением такой зараженной пищи, как мясо, овощи, пудинги и соусы, а рвотный тип обычно связан с употреблением риса. Используя систему API, можно отличить патогенные штаммы В. cereus от других штаммов (Logan et al, 1979). Bacillus subtilis и В. licheniformis также рассматривали как причину пищевых отравлений, и клетки этих бактерий выделяли в большом количестве из фекалий пациентов, однако патогенность редко подтверждалась (Gilbert et al, 1981).

Из фекалий здоровых людей и животных были выделены различные бациллы, однако эти микроорганизмы являются временными обитателями кишечного тракта, попавшими туда с пищей. В пищеварительном тракте животных встречаются различные крупные бактерии, образующие эндоспоры.

Многие из них имеют две или более спор на клетку, некоторые растут в виде септированных нитей, другие образуют спирали. Таксономия этих бактерий неясна, неизвестно также, образуют ли они типичные эндоспоры, содержащие дипиколиновую кислоту (Gibson, Gordon, 1974).

Бациллы являются, вероятно, важными компонентами экосистемы рубца жвачных животных. Штаммы, выделенные из рубца коровы, овцы и козла,

идентифицированные как В. ticheniformis, В. circulans, В. coagulans, В. laterosporus, а также не идентифицированные факультативные анаэробы,

напоминающие В. pumilus, способны гидролизовать гемицеллюлозу и,

возможно, играют важную роль в питании их хозяев (Williams, Withers, 1981, 1983). Кроме того, клетки В. macerans участвуют в фиксации азота в рубце

(Jones, Thomas, 1974).

26

Бациллы сибирской язвы, как правило, заболевание травоядных животных (млекопитающих), но также вызывают заболевание у человека.

Инфекция у людей встречается реже, чем инфекции у животных.

Заболевание возникает у людей, при контакте с животными или продуктами животного происхождения. Раньше это было профессиональным заболеванием,

обычно болели ветеринары, люди, которые разводили скот, и люди, которые изготавливали изделия из шерсти, кожи и волос животных. Продукция из стран,

где сибирская язва у животных распространена по - прежнему является проблемой.

У человека есть три возможные формы заболевания сибирской язвой.

Исторически сложилось, что наиболее распространенной формой была кожная форма сибирской язвы, при которой в организм сибирская язва поступает через повреждения на коже. Кожная форма начинается с папулы в начале, которая прогрессирует в течение нескольких дней, а затем после истечении определенного периода, развиваются характерные черные струпы. У пациента может быть лихорадка, недомогание и головная боль (Friedlander, 1999).

Более серьезная форма - легочная форма сибирской язвы. При этой форме развивается тяжелое заболевание дыхательных путей. Системная инфекция в результате вдыхания бациллы сибирской язвы имеет смертность

100%. Первоначальными симптомами являются симптомы как при гриппе,

прогрессирующих к артериальной гипотензии, шока и массивной бактериемии и токсикоз. Раннее лечение антибиотиками является абсолютной необходимостью и должно быть начато в течение инкубационного периода,

если человек подвергся заражению. После того, как острые симптомы появились, антибиотики могут убить микроорганизмы, но не уничтожить мощные токсины, которые уже попали в организм, и человек обычно умирает через 2-3 дня от дыхательной недостаточности, сепсиса и шока (Dixon et al, 1999).

Третья форма, кишечные язвы, от употребления зараженного мяса. В странах,

где голод является серьезной проблемой, употребление зараженного мяса

27

приводит к серьезным последствиям. Заболевание сибирской язвы начинается с тяжелой ангины или язвы в полости ротоглотки, шеи, сопровождается отеком и лихорадкой. Желудочно-кишечная язва начинается анорексией, тошнотой,

рвотой и болями в животе. Кишечная язва может стать системной и привести к смерти (Human ingestion of Bacillus anthracis - contaminated meat Minnesota, August 2000. CDC and Prevention / Morb. Mortal. Weekly Rep., 2000).

2.4 Насекомые

Несколько видов бацилл патогенны для насекомых. Бактерии вида

Bacillus popilliae и близкородственные бактерии В. lentimorbus облигатно патогенны для различных представителей семейства Scarabaeidae (Coleoptera).

Поскольку эти бактерии спорулируют в гемолимфоживых скарабеев, их обычно выделяют из зараженных личинок или из почвы инфицированных районов

(Bulla et al, 1978; Milner, 1981).

Клетки Bacillus tkuringiensis образуют в процессе споруляции кристаллы белка, токсичного для личинок разных насекомых. Различные штаммы имеют разные спектры действия: некоторые (например, varisraelensis) патогенны для личинок комаров и москитов, другие (vartenebrionsis и varSanDiego) - для некоторых жесткокрылых, включая колорадского жука и хлопкового долгоносика (Hernstadt et al, 1986). Эти бактерии широко распространены в почве; выделяют их и из зараженных насекомых.

Было показано, что для личинок москитов и комаров патогенны некоторые штаммы В. sphaericus, B. larvae вызывает американский гнилец у медоносной пчелы и может быть выделен из зараженных насекомых и мест их обитания. Существуют и другие штаммы Bacillus, связанные с пчелами, но они не патогенны. К ним относятся В. alvei, «В. apiarius», В. laterosporus и В. pulvifaciens (Bucher, 1981). Из некоторых насекомых были выделены бактерии

Bacillus circulans. Однако для большинства бацилл, в особенности для

28

аэробных видов, таких как В. megaterium, В. subtilis и ряда других, такая среда обитания, как насекомые, не характерна (Bucher, 1981; Breznak, 1982).

2.5 Растения

Бактрии рода Bacillus рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней растений в силу их широко распространенного природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам. В последнее десятилетие во многих ведущих агропромышленных странах были созданы и испытаны некоторые препараты на основе бацилл-

антагонистов. Однако зачастую, применение таких биопрепаратов оказывалась мало - или абсолютно неэффективным. Причина неудач в этих случаях кроется в недостаточной изученности жизнедеятельности почвенных бацилл при их взаимодействии с растениями и фитопатогенной микрофлорой. Бактерии рода

Bacillus не относятся к типично ризосферным. Вместе с тем, при искусственной инокуляции посевного материала они способны длительное время развиваться и доминировать в прикорневой зоне растений, выдерживая конкуренцию со стороны аборигенной и фитопатогенной микрофлоры. На способность бактерий приживаться в ризосфере и осуществлять жизнедеятельность оказывают влияние как биогенные факторы так и условия внешней среды. Продукты жизнедеятельности бацилл могут оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на растения. Состав, как продуцируемых метаболитов, так и секретируемых ферментов, определяющих взаимоотношения интродуцированных бацилл с растениями и патогенной микрофлорой исследован недостаточно.

Не достаточно исследованы воздействия антибиотических веществ,

продуцируемых бациллами различной видовой принадлежности на характер воздействия на фитопатогенные грибы. Не установлена роль миколитических ферментов в проявлении антагонизма бацилл к мицелиальным грибам. Решение

29

этих проблем позволит ускорить внедрение в практику биологических методов защиты растений от болезней и создание высокоэффективных биопрепаратов на основе бацилл-антагонистов (Меленьтев, 2000).

2.6 Краткая характеристика некоторых значимых видов рода Bacillus

Bacillus amarus – грамположительные спорообразующие бактерии (0,7- 1,3 х 3,6-5,6 мкм). Обитают в морской воде на глубине 750 м. Участвуют в круговороте азота.

Bacillus angulans – грамположительные подвижные палочковидные бактерии (1,8 х 4,7 мкм). Образуют центральную спору. Клетки располагаются цепочкой. Аэробы. Обитают в морской воде на глубине 1500 м. Участвуют в круговороте азота.

Bacillus anthracoides – грамположительные подвижные палочки (0,7-1,3 х 5,3-12,9 мкм). Образуют центральную спору. Клетки располагаются цепочкой.

Аэробы. Обитают в почве, в воде пресных водоемов, в морской воде на глубине

100-1000 м. Участвуют в круговороте азота (аммонификатор).

Bacillus anthracis – грамположительные крупные палочки с обрубленными концами (0,5-2,5 х 1,2-10 мкм). Клетки располагаются цепочкой.

Неподвижные. Аэробы. При неблагоприятных условиях образуют центральную спору, по диаметру не превышающую диаметр клетки. В макроорганизме клетки окружены капсулой, в одной капсуле находятся 2-4 особи (зооглея).

Температурный оптимум 37оС. Вызывают у человека и животных острое инфекционное заболевание - сибирскую язву (антракс). К сибиреязвенным бациллам чувствительны все травоядные животные, в том числе, крупный и мелкий рогатый скот, лошади, олени. Сибирской язвой болеют свиньи, собаки,

волки, лисы, дикие и домашние птицы. Заражение человека и животных осуществляется алиментарно, аэрогенно, контактно через поврежденную кожу или слизистую. Источник заражения - больные животные, трупы погибших.

Факторами передачи возбудителя могут быть контаминированные корма, вода,

30