Общая характеристика бактерий рода BACILLUS

свойствами в отношении большого числа микроорганизмов. Спороносные бактерии можно поставить в один ряд с лучистыми грибками, пенициллами и аспергиллами, представляющими собой основные источники получения антибиотических веществ.

Подавляющее большинство антибиотиков бактериального происхождения выделено из группы спорообразующих бактерий. Первый антибиотический препарат - грамицидин - выделен из культуры спороносной бактерии. Советскими учеными был получен антибиотик грамицидин С,

который успешно используется при лечении многих инфекций. Из различных видов бацилл получены антибиотики альвеин, бациллин, бацитрацин,

лихениформин, субтилин, циркулин и др. Особый интерес вызвало открытие полимиксинов - антибиотиков бациллярного происхождения, которые оказались высокоактивными против грамотрицательных бактерий. В ряде стран организовано промышленное производство отдельных препаратов антибиотиков: полимиксина В, колистина, бацитрацина.

Кроме терапевтического использования, бацитрацин применяется в качестве стимулятора роста животных.

В настоящее время из различных видов спорообразующих бактерий выделено более 60 антибиотиков, из которых некоторые были испытаны в клинической практике. Однако антибиотики, полученные из спорообразующих бактерий, изучены недостаточно.

За некоторыми исключениями, антибиотики из спорообразующих бактерий представляют собой вещества белковой природы - полипептиды. Они состоят из различных аминокислот, причем наиболее характерным является то, что в состав полипептидных антибиотиков входят неестественные аминокислоты с правой оптической конфигурацией. Некоторые антибиотики полипептидной природы имеют сравнительно более простой состав и несложную формулу,

представляя весьма удобную модель для изучения строения белка. С другой стороны, полипептидные антибиотики привлекают большой интерес биохимиков, так как эти вещества могут быть использованы при изучении

41

одной из центральных проблем современной биологии - выяснении причин,

обусловливающих специфичность биологически активного белка.

По механизму действия продуцируемые спорообразующими бактериями антибиотики разделяются на три группы. Группа эдеинов, представляющих собой пептиды с сильно основными свойствами, специфически подавляет синтез ДНК. Группа бацитрацинов и родственных им антибиотиков представляет собой циклические пептиды, которые угнетают синтез оболочки клеток. В обширную группу бациллярных антибиотиков включают грамицидины, полимиксины и родственные им соединения, которые специфически блокируют синтез структурных компонентов или функцию клеточной мембраны. Характерной особенностью этих антибиотиков является то, что они образуются после активного размножения бактерий в процессе спорообразования. Результаты генетических исследований свидетельствуют,

что биосинтез бациллярных антибиотиков тесно связан с образованием протеазы, характерной для процессов спорообразования. Поэтому синтез антибиотиков отражает особенности биохимической дифференциации клеток спорообразующих бактерий (http://molbiol.ru/wiki).

3.1 Спектр активности пробиотиков на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus (Бакулина, 2001)

43

Глава 4 Получение накопительных культур и идентификация рода Bacillus

4.1 Традиционный подход к идентификации видов

Традиционный подход к идентификации видов Bacillus в значительной степени основывается на морфологии спор. Вид относят к одной из трех групп в зависимости от того, являются ли споры: I) овальными и того же диаметра,

что и спорангий; II) овальными, но большего диаметра, чем спорангий, что вызывает его «разбухание», или III) круглыми. Для правильной идентификации на основе такого разделения необходимо хорошо знать эти типы бактерий,

однако большую помощь могут оказать отличные микрофотографии.

К бактериям группы I относятся группа В. subtilis и некоторые другие,

часто встречающиеся бациллы. Существуют трудности с разграничением В. amyloliquefaciens и В. subtilis, но обычно их можно различить по признаку синтеза ДНКазы, а также по способности сбраживать лактозу и ксилозу. У В. amyloliquefaciens первый признак отсутствует, второй имеется, третий отсутствует, тогда как у В. subtilis характеристики противоположные (Priest et al, 1987). Однако наиболее надежным способом различения этих таксонов является гибридизация ДНК. Вид Bacillus megaterium считается гетерогенным,

но клетки В. megaterium sensustricto обычно можно отличить по их крупным размерам. Клетки В. cereus, В. anthracis, В. thuringiensis и В. mycoides трудно отличимы друг от друга и их ДНК действительно обнаруживают высокую степень гомологии. В. thuringiensis можно распознать по наличию параспорального тела, а В. mycoides - по ризоидному росту.

Группа II представляет собой гетерогенное собрание видов. Для Bacillus macerans и В. polymyxa характерно выделение газа в процессе сбраживания сахаров, а штаммы В. alvei, как правило, образуют подвижные колонии.

Распознавание B. circulans представляет определенные трудности, так как на основе данных по гомологии ДНК в пределах этого, таксона различают по крайней мере 10 групп. Попытки решить эту проблему привели к созданию

44

видов В. pabuli, В. lautus, В. amylolyticus и В. validus (Nakamura, 1984). В эту группу включены патогенные для насекомых В. larvae (вызывает американский гнилец медоносной пчелы), В. lentimorbus и В. popilliae (вызывает молочную болезнь личинок жука-навозника), которые не выживают при последовательных пересевах в питательном бульоне и не содержат каталазы.

Наконец, к этой группе относится гетерогенный таксон В. stearothermophilus

включающий, вероятно, по крайней мере три таксона в ранге вида (Sharp et al, 1980).

Для штаммов группы III характерна сферическая форма спор. Из бактерий этой группы наиболее распространенной является, вероятно, B. sphaericus, но опять-таки это название относят к бактериям, которые можно разделить по гомологии ДНК примерно на семь групп. Дифференцировать эти таксоны по фенотипическим признакам в настоящее время практически невозможно. Другие организмы, образующие сферические споры - это

расположение споры центральное. Аэробы, каталазоположительные. По идентификационной таблице предложенной Норрисом (Norris et al, 1981)

штамм №7 был отнесён к виду Bacillus pumilus, по признакам перечисленным в таблице ниже:

45

Кроме того, в международном генном банке зарегистрирован 3779 фрагмент последовательностей гена 16S рибосомальной РНК, которые отнесены к роду

Bacillus. Так же получены полные геномы для 38 штаммов бацилл

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

46

4.2 Некоторые способы получения накопительных культур для селективного выделения штаммов Bacillus

48

Глава 5 Изучение Bacillus в водной среде

5.1 Выделение чистых культур из водных образцов

Для выделения бацилл из водных образцов используют метод прямого глубинного посева 1-2 мл. исследуемой воды (Родина, 1965); из донных осадков образцы обрабатывают согласно следующей методике. Образец исследуемого донного осадка в количестве 0,5 гр. берут лопаткой,

обработанной спиртом, и стерильно вносят в колбу емкостью 100 мл. с 50 мл.

стерильной дистиллированной воды. В течение 30 мин. грунт встряхивают на качалках со скоростью 150 об./мин. при амплитуде 5. После этого суспензии дают отстояться и используют ее для разведений.

При выделении и учете количества бактерий исследуемой группы используют чашечный метод Коха. Сущность данного метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. Полученную суспензию и разведения в количестве 1 мл. вносят в чашки Петри, заливают стерильной питательной средой РПА:10 с добавлением сульфата марганца.

Культивирование посевов проводят при температурах 40, 250 и 370С.

Выделение споровой стадии бацилл. Для выделения споровой стадии бацилл перед посевом водные образцы и суспензии донных отложений пастерилизуют (10 мин. при 60-750С), чтобы убить вегетативные клетки и оставить жизнеспособные споры. Посев осуществляют на РПА:10. Отбор колоний проводят по морфологическим признакам, характерным для представителей рода Bacillus.

Выделение термофильных бацилл. При выделении термофильных бацилл используют метод накопительной культуры. Термофильные бактерии культивируют и выделяют, применяя селективные среды, при температуре

530С.

49

Идентификация культур. Морфологический анализ. Штаммы микроорганизмов идентифицируют согласно методике, предложенной Дж. Р.

Норрисом с соавторами (Norris et al, 1981). Суточные чистые культуры окрашивают по Граму. При обычных способах окраски по Граму споры либо не прокрашиваются, либо прокрашиваются очень слабо, т.к. оболочка споры состоит из нескольких покровов и кортекса и имеет вид светлых включений на фоне окрашенной плазмы (Суслова, 2007).

Биохимические тесты. Идентификацию бактерий до вида проводят после изучения следующих признаков: наличие у чистых культур микроорганизмов амилазы, нитратредуктазы, протеазы, выявление пигментообразования, способность роста при 650С, при 500С, на РПА с 7% NaCl, а также в анаэробных условиях. Обязательным признаком в идентификации является V-P реакция. Необходимо учитывать наличие параспоральных тел в спорангии, которые определяют принадлежность к энтопотагенным видам рода Bacillus (Краткий определитель Берджи, 1980).

Определение ферментативной активности. Каталаза. Каталазную активность выявляют следующим образом: исследуемую культуру выращивают на поверхности плотной питательной среды, на которую затем наносят каплю

10% раствора перекиси на колонию. Выделение кислорода, хорошо заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствует о продукции клетками каталазы

(Практикум по микробиологии, 1976).

Фосфотаза. Для определения фосфатазной активности используют стандартный набор реагентов ALKALINE PHOSPHOTASE «FL». Стандартный набор реагента, содержащий n-нитрофенилфосфат, капают в планшетки по 0,25

мл. в каждую лунку, когда вносят биомассу исследуемых культур в размере 1

бактериальной петли. При положительной реакции, т.е. при действии бактериальной щелочной фосфотазы, n-нитрофенилфосфат расщепляется на n-

нитрофенол и фосфат, о чем свидетельствует желтая окраска индикатора.

Фосфотазную активность оценивают по интенсивности желтой окраски

50