1. Количественные методы

1) тесты розеткообразования

2) определение субпопуляций лимфоцитов в реакции иммунофлюоресценции (РИФ) с моноклональными антителами (МКАТ).

3) Определение субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии

2. Оценка функциональной активности клеток иммунной системы

1) РБТЛ-реакция бластной трансформации лейкоцитов

2)РТМЛ- реакция торможения миграции лимфоцитов

ТЕСТЫ РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ.

Е-РОК - применяется для определения Т- лимфоцитов. Т.к. эти клетки обладают рецепторами к эритроцитам барана, Лейковзвесь соединяют со взвесью эритроцитов барана, и лимфоциты, присоединившие к себе 3 и более эритроцита, учитываются как Т-клетки.

Норма – 48 –65%, абс. – 0,72 –2,22 (х10⁹г/л).

ЕАС-РОК - выявляют лимфоциты, имеющие на своей поверхности рецепторы к комплементу, это В- клетки

Норма 10-27, абс. 0,15-0,92.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ (МКАТ).

На поверхности лимфоцитов находятся группы рецепторов, называемые кластерами детерминант (CD). Для каждой субпопуляции лимфоцитов характерны определенные СD. Принцип метода основан на том, что МКАТ присоединяются к соответствующим рецепторам на поверхности лимфоцитов, а участки их фиксации выявляются с помощью флюоресцирующей сыворотки. Количество клеток, на которых обнаруживается свечение, характеризует численность популяции с данными рецепторами.

СD3- присутствует на зрелых Т-лимфоцитах.

CD4 – обнаруживается на Т-лимфоцитах, обладающих хелперной (для продукции иммуноглобулинов) и индукторной (генерирующей цитотоксические Т-клетки, отвечающие за пролиферацию и продукцию лимфокинов).

CD8 - находится на Т-лимфоцитах, обладающих супрессорной и цитотоксической активностью.

CD19 – находится на В-лимфоцитах

CD 16- находится на натуральных киллерах (NK- клетки)

Нормы: CD3 - 55-80%

CD4 - 31-49%

CD8 - 19-37%

CD19 - 5-19%

CD16 - 5-18%

Иммунорегуляторный индекс –ИРИ- = CD4/CD8. Норма - 1,3-1,5.

При иммунодефицитных состояниях снижается количество лейкоцитов, лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов. ИРИ меньше 1,0. Например, при прогрессирующей гнойной интоксикации истощается система комплемента, снижается количество Т-клеток, Т-хелперов, увеличивается количество супрессоров. Снижается ИРИ до 0,5-0,4. Кроме того, уменьшается фагоцитарная активность нейтрофилов, количество иммуноглобулинов и нарастает содержание О-клеток.

При аутоиммунных заболеваниях нарастает содержание Т-хелперов, В-клеток. Снижается количество Т-супрессоров. ИРИ обычно около 2.

РТМЛ - РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ

С МИТОГЕНАМИ.

Норма -0,2-0,8.

Метод используется для оценки клеточной иммунореактивности in vitro с митогенами при исследовании иммунного статуса. В норме происходит выработка фактора торможения миграции лейкоцитов. Этот процесс может быть нарушен при ИД состоянии.

Оценка гуморального звена иммунитета

Определение уровня сывороточных иммуноглобулинов G, А, М.

Количественные определения в сыворотки крови иммуноглобулинов основных классов M, G, A проводятся методами

• радиальной иммунодиффузии,

• ИФА

Нормы в г/л:

IgG -6,6-16,0

IgA - 0,7- 5,0

IgM -0,62 - 1,82

Метод высоко информативен в диагностике первичных и вторичных иммунодефицитных состояниях и хронических инфекциях.

Ig M - повышается при перинтальных инфекциях (цитомегаловирусная, токсоплазмоз, краснуха, и др. вирусные инфекции); также повышается при острых септических состояниях, инфекционном мононуклеозе, микоплазменной пневмонии, вирусных гепатитах, циррозе, ревматоидном артрите, особенно в начальном, трудном для диагностики периоде артритов, при обострении СКВ. При некоторых заболеваниях повышение уровня Ig М свидетельствует о хроническом процессе.

Повышение уровня IgМ наблюдается при макроглобулинемии Вальденстрема, бессимптомной моноклональной гаммапатии (редкие случаи), наличии холодовых IgM агглютининов.

IgM-снижается при первичных и вторичных ИД состояниях, при гастроэнтеропатиях, ожоговой болезни, иммунодепрессивной терапии.

IgG - повышается при разных заболеваниях, его повышение часто сопутствует активности процесса. Высокие концентрации данного иммуноглобулина наблюдаются при аутоиммунных процессах, острых инфекционных состояниях в фазу вторичного иммунного ответа. Увеличение концентрации моноклональных IgG имеет место при IgG-миеломе, бессимптомной моноклональной гаммапатии (редкие случаи).

Уровень IgG снижается при первичных и вторичных ИД, при гастроэнтеритах с потерей белка, при нефротическом синдроме, при иммунодепрессивной терапии.

IgA - повышается при перинатальных инфекциях, хронических заболеваниях печени, подострых и хронических инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, IgA - миеломе, бессимптомной гипергаммаглобулинэмиии (редкие случаи).

Снижение уровня IgA отмечается при ИД, ожоговой болезни, селективном дефиците IgA. Лица с дефицитом IgA предрасположены к аутоиммунным и аллергическим заболеваниям.

Оценка фагоцитарного звена иммунитета

Методы:

• Определение фагоцитарной активности (поглотительной способности) - фагоцитоз с латексом или с культурой бактерий

• Определение переваривающей способности фагоцитов - фагоцитоз с культурой стафилококка

• Определение активности «кислородного взрыва» - НСТ-тест

• Оценка фагоцитарного звена методом проточной цитометрии

ФАЛ- ФАГОЦИТОЗ С ЧАСТИЦАМИ ЛАТЕКСА.

Для определения поглотительной способности нейтрофилов используется тест с частицами латекса (или взвесью бактерий). Для этого взвесь частиц латекса соединяют с гепаринизированной кровью больного. После инкубации готовят мазок и окрашивают его по Романовск

Затем при микроскопии мазка определяют процент активных (т.е поглотивших нейтрофилов - фагоцитарную активность.

Норма:52-90%

ФСт – ФАГОЦИТОЗ С КУЛЬТУРОЙ СТАФИЛОКОККА

Метод основан на способности нейтрофилов крови поглощать и переваривать микроорганизмы. Это является важнейшей характеристикой функций гранулоцитов. Ее снижение может быть результатом как недостаточности опсонизирующих факторов сыворотки (антител, комплемента), так и дефектов самих клеток (нарушение двигательной и метаболической активности врожденного или приобретенного характера).

Гепаринизированную кровь соединяют со взвесью бактерий (St. epidermidis.). Результаты оценивают через 30 минут и через120 минут. Поглотительная способность клеток оценивается по 2 показателям:

-ФА – фагоцитарная активность или процент фагоцитоза – это % нейтрофилов, поглотивших бактерии, от общего числа нейтрофилов. Норма 52- 90%, абс – 0,85 – 3,7.

ФЧ – фагоцитарное число – это среднее число поглощенных бактерий одним активным нейтрофилом.

Норма – 4,5 – 10.

Для определения переваривающей способности нейтрофилов эти же показатели определяют через 120 минут.

В норме через 30 минут начинается переваривание поглощенных микробов и поэтому значение ФА и ФЧ через 120 минут будут ниже, чем через 30 минут.

ИЗФ – индекс завершенности фагоцитоза определяется соотношением ФЧ через 30мин. к ФЧ через 120 мин. Поэтому он в норме больше 1.

Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе и диагностике иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующих гнойных воспалительных процессов, при длительно незаживающих ранах и т.д. Помогает в диагностике вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных лекарственной терапией, позволяет оценивать эффективность лечения. В связи с тем, что фагоциты участвуют в элиминации иммунных комплексов , их деятельность тесно связана с системой комплемента и уровнем IgG. Эти показатели имеют значение при оценке активности процесса и эффективности терапии при аутоиммунных заболеваниях.

НСТ-ТЕСТ - СПОНТАННЫЙ И СТИМУЛИРОВАННЫЙ.

Принцип метода основан на способности нейтрофилов поглощать нитросиний тетразолий и восстанавливать его в гранулы нерастворимого диформазана в виде гранул синего цвета. Восстановление НСТ обеспечивается энергией и продуктами окислительно- восстановительных реакций “метаболического взрыва”, сопровождающего процесс фагоцитоза. К гепаринизированной крови добавляют НСТ, инкубируют и затем в мазках определяют процент нейтрофилов, содержащих гранулы диформазана. Это спонтанный НСТ, в норме он от3 до 15%.Для выявления резервов бактерицидной функции нейтрофилов применяют стимулированный НСТ-тест. При этом в лунку еще добавляют стимулятор фагоцитоза (латекс, пирогенал, зимозан и т.д.).В норме стимулированный НСТ-тест на 40-80%выше спонтанного.

Это тест может быть использован для дифференциальной диагностики бактериальных (высокие результаты) и небактериальных (нормальные показатели) заболеваний, протекающих с лихорадкой, лейкоцитозом, высокой СОЭ. Однако следует помнить,что высокие показатели НСТ-теста отмечаются при паразитарных инвазиях, вирусном гепатите, грибковых поражениях легких, туберкулезе. Кроме того, высокие показатели теста наблюдаются при многих небактериальных процесах: инфаркте миокарда, переломах, оперативных вмешательствах, лейкозах, у онкологических больных.

Определение уровня общего комплемента

СН-50 - ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ КОМПЛЕМЕНТА ПО 50% ГЕМОЛИЗУ

Комплемент (С) - сложный комплекс белков плазмы крови, участвующих в

воспалительной реакции и иммунных процессах:

-цитолиз клеток,

-усиливают фагоцитоз в качестве опсонинов,

-вызывают дегрануляцию гранулоцитов,

--выполняют регуляторную функцию, стимулируют активность различных популяций лимфоцитов и др.

Норма - 40- 80 ед.

Комплемент является объективным показателем иммунологической реактивности организма. Принимает активное участие в защите организма от инфекции. Любой воспалительный процесс при адекватном ответе сопровождается повышением уровня комплемента разной степени выраженности. Низкое содержание комплемента наблюдается при первичных и вторичных ИД. Дефицит комплемента отмечается при заболеваниях, протекающих с образованием иммунных комплексов, что приводит к избыточному потреблению компонентов комплемента (СКВ, острый гломерулонефрит, аутоиммунная гемолитическая анемия, болезни печени, сепсис, ожоги, повреждение тканей и т.д.), а также при наследственных дефицитах компонентов комплемента. Резкое снижение комплемента наблюдается при анафилактических реакциях.

Определение интерферонового и интерлекинового статуса

Цитокины – белки, образуемые активированными клетками иммунной системы, реже другими клетками (эпителием, фибробластами), обеспечивающих рост и пролиферацию многих клеток, а также межклеточные взаимодействия и иммунорегуляцию.

К цитокинам относятся интерфероны(ИФН,IF), интерлейкины (ИЛ, IL), фактор некроза опухолей (ФНО, TNF) и др.

Интерлейкины –ИЛ – цитокины, ответственные за межклеточные взаимодействия между лейкоцитами. Описано более 30 ИЛ. Они обозначаются цифрами ИЛ-1, ИЛ-2 и т.д.

По профилю цитокины можно разделить на провоспалительные и противовоспалительные,

• Провоспалительные цитокины – ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, фактор некроза опухолей (ФНО)- альфа, интерфероны (ИФ) альфа и гамма способствуют развитию раннего воспалительного ответа.

• Противовоспалительные цитокины – ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, ФНО-бета ограничивают развитие воспаления на заключительных этапах иммунного ответа.

Методы определения:

• ИФА

• Проточная цитометрия

Омский государственный медицинский университет

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

УТВЕРЖДАЮ

Зав.кафедрой ___________________

Н.В. Рудаков

(Расшифровка подписи)

«____»______________ 20____года