Барам_Курс лекций ВЭЖХ для ВСЕХ [2007]
.pdf
ВЭЖХ - 2006 |
КОСВЕННОЕДЕТЕКТИРОВАНИЕ |
||||
|
ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ |
||||
|
O N |
F |
+ H N CH COOH |
O2N |
NH CH COOH |
|
2 |
|
2 |
|
R |
|
|
|
R |
|
|
|
NO2 |
Фотометрия |
|
NO2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
N C S + H2N CH COOH |
N C NH CH COOH |
|||
|
|
|
R |
|
R |
|
O2N |
F |
+ H2N CH COOH |
O2N |
NH CH COOH |
|
|
|
|
R |
|
|
N O N |
|
R |
N O N |
|
|
|
|
|||
|
N(CH ) |
|
Флуориметрия N(CH ) |
|
|
|
3 |
|
|
3 |
|
|
|
|
+ H2N CH COOH |
|
|
|
|
|
R |
|
|
|
O S O |
|
O S NH CH COOH |
||
|
Cl |
|
|
O |
R |
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
|
|
КОСВЕННОЕДЕТЕКТИРОВАНИЕ |
||||
|
ПОСТКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ |
||||
Фотометрия
O |
O |
O |
OH |
H2N CH COOH |
N |
+ |
R |
|
OH |
H |
|
|
|
|
O |
O |
O |
Флуориметрия
COH |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
COH |
+ |
H2N |
|
CH |
|
COOH |
|
|
N |
|
|
CH |
|
COOH |
|
|
|
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
R |
|
|
|
|
R |
||||||||
+ |
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
SCH2CH2OH |
|||||||||||||
HSCH2CH2OH |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
70
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
|
КОСВЕННОЕДЕТЕКТИРОВАНИЕ |
|||
|
Фотометрирование |
|
||
А |
|
|
1 |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
3 |
|
А |
1 |
2 |
В |
|
|
|
|
Объем |
|
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
|
КОСВЕННОЕДЕТЕКТИРОВАНИЕ |
|||
|
Фотометрирование |
|
||
|
C l- |
|
|
|
|
|
|
0.02 A 240 |
|
|
N O 2- |
|
|
|
|
H C O 3- |
|
|
|
|
B r- |
N O 3- |
SO 42- |
|
|
|
|
|
|
H PO 4-
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
Время, мин
ХРОМАТОГРАФ: "Милихром А-02"
КОЛОНКА: 2x75 мм с Nucleosil 100-5 C18 (модифицирована бромидом триметилоктадециламмония)
ЭЛЮЕНТ: H2O - CH3CN - 16 мМ фталат натрия, pH 8.9 (80:10:10)
СКОРОСТЬ ПОТОКА: 0.1 мл/мин ТЕМПЕРАТУРА: 35°С
ОБРАЗЕЦ: 10 мкл натриевых солей (по 10 мг/мл каждой в воде)
G.I.Baram, A.L.Vereshchagin, L.P.Golobokova. Zhurnal Analiticheskoy Khimii, 54, No.9 (1999) 962-965
71
Лекция 6
ВЭЖХ и скрининговые задачи. Базы данных "ВЭЖХ-УФ"
Г.И.Барам Курс лекций "ВЭЖХ для ВСЕХ"
Новосибирск, 2007
72
ВЭЖХ - 2006
ФОТОМЕТРИЯ
l
Лампа |
|
|
|
|
|
|
Фотоприемник |
Закон |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ламберта-Бургера-Бера |
|
|
I0 |
|
|
|
I |
|
|
|
|
|
|
I = I0 10 |
−ελ C l |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
Ячейка с раствором вещества |
|
||||||||||||||
|
с концентрацией C |
|
|
|
|
|
|||||||||
Пропускание света |
|
|
|
Поглощение света |
|||||||||||
(100 0%) |
|
|
|
(0 ∞) |
|
||||||||||
T = |
|
I |
100% |
Aλ |
= −logT = ελ C l |
||||||||||
|
|
||||||||||||||
|
|
I0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Поглощение раствора вещества при длине волны λ прямо пропорционально концентрации вещества
ВЭЖХ - 2006 |
ФОТОМЕТРИЯ |
|
|
||
|
|
Линейность |
Аλ |
|
|
|
A>1-1.5 |
|
0 |
|
C>10-100 мг/л |
|
C |
|
|
Заслонка |
Заслонка |
|
|
|
Измерение темнового тока |
Измерение рассеяного света |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Измерение флуоресценции |
|
|
Измерение поглощения элюента |
|
|
|
|||||||||||
73
ВЭЖХ - 2006
УФ-СПЕКТРОСКОПИЯ
Влияние растворителя
Аотн 1.0 |
CH3CN |
|
|
||
0.8 |
CH3CN:H2O (1:1) |
|
H2O |
||
|
||
0.6 |
|
0.4
0.2
0
220 240 260 280 300 320 нм
Cпектры растворов нитробензола, нормированные относительно спектра водного раствора
ВЭЖХ - 2006
УФ-СПЕКТРОСКОПИЯ |
||||||
|
Влияние растворителя |
|
||||
1.0 |
|
|
рН 2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.8 |
|
|
|
|
|
|
отн 0.6 |
|
|
|
|
рН 5 |
|
А |
|
|
|
|
|
|
0.4 |
|
|
|
|
|
|
0.2 |
Изобестические |
|
|
|
||
0 |
|
точки |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
220 |
240 |
260 |
280 |
300 |
320 нм |
Спектры растворов 4-нитробензойной кислоты
(рКа 4-нитробензойной кислоты 3.4)
74
ВЭЖХ - 2006
УФ-СПЕКТРОСКОПИЯ
Влияние растворителя
А
R-COO
1.4
1.2
рКа
1.0
R-COOH
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
|
рН раствора |
|
|
||
Величина рН и поглощениe раствора кислоты
рКа=5; С0=0.0001 М; εRCOO-=10000; εRCOOH=15000; l=1 cм
ВЭЖХ - 2006
МАТЕРИАЛЬНЫЙБАЛАНС
ВХРОМАТОГРАФИИ
Концентрация |
ОБРАЗЕЦ |
Хроматография |
ПИК |
|
|||
СS |
|
|
|
|
w |
h |
|
|
|
h |
|
|
|
2 |
|
|
VS |
|
VR |
|
|
Объем |
|
Количество вещества в образце равно количеству вещества в соответствующем ему хроматографическом пике
Qs =Cs Vs =∫C dV
где Qs - количество вещества в введенном в колонкуобразце Сs - концентрация вещества в образце;
Vs - объем образца
С - текущая концентрация вещества в элюате V - текущий объем элюата
75
ВЭЖХ - 2006 |
|
МАТЕРИАЛЬНЫЙБАЛАНС |
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
ВХРОМАТОГРАФИИ |
|
|
|
|||||||
|
ОБРАЗЕЦ |
Хроматография |
ПИК |
Для фотометрического детектора: |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
A=εC l |
|
|
|
|||||
Концентрация |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
As Vs |
= h σ |
2π ≈ 1.06 h w |
||||||
Сs |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ε Cs l Vs |
N |
|
|
||
|
|
|
|
w |
|
|
h = |
|
|
||||||
|
|
|
|
h |
|
h |
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
' |
|
|
|
||||
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
V0 (1 + k ) |
2π |
|
|
||
|
|
Vs |
|
|
|
Vr |
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
As - поглощение раствора образца |
|
|
|||||||
|
|
|
Объем |
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
h - высота пика в единицах оптического поглощения |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
σ - стандартное отклонение гауссова пика |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
w - ширина пика на половине его высоты |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
ε - коэффициент экстинкции вещества |
|
||||||
|
|
2A |
V |
(1 + k' ) |
2π |
l - длина оптического пути измерительной ячейки |
|||||||||
Cмин = |
N - эффективность хроматографической колонки |
||||||||||||||
|
шум |
0 |
|
|
V0 - свободный (мертвый) объем колонки |
|
|||||||||
|
|
|
ελ l Vs |
N |
|
k' - фактор удерживаниявещества |
|
|
|||||||
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
СРАВНЕНИЕСПЕКТРОВ |
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
||||||||||
ε |
|
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ |
А |
Хроматограмма |
|
|
ХРОМАТОГРАФИЯ |
|
|||||||
|
|
|
фиксированная |
|
|
2 |
|
|
|
спектры в точках 1, 2 и 3 |
|||||
|
|
|
концентрация |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
λмакс |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
εмакс |
|
|
|
λмакс |
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
λмин |
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|||
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
λмин |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
εмин |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
210 |
|
230 |
250 |
270 |
290 нм |
Объем (Время) |
|
|
|
ХРОМАТОГРАФИЯ |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
нормированные спектры |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
) |
2.0 |
в точках 1, 2 и 3 |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
макс |
1.5 |
|
|
|
|
|
|
R = Aλ |
= ελ C l = ελ |
= const |
А(λ |
|
|
|
|
|||||||
|
1.0 |
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
A0 |
ε0 C l ε0 |
|
А()/λ |
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
λмакс |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
210 |
230 |
250 |
270 |
290 нм |
|
|
|
|
|
|
|
|
76 |
|
|
|
|
|
|
|
ВЭЖХ - 2006
СРАВНЕНИЕСПЕКТРОВ
ПОГЛОЩЕНИЯ
2.5 |
274 |
Нормированные спектры |
|
Спектральные отношения |
||||||
/А |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
210 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2.0 |
А |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
274 |
|
|
|
|
|
|
|
274 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
А/ |
|
274 |
|
/А |
|
|
|
|
|
|
λ |
|
А/ |
274 |
274 |
274 |
|
|
|
|
|
А |
|
230 |
/А |
А |
/А |
|
|
|
|
274 |
1.0 |
|
А |
250 |
|
290 |
|
|
|
|
|
|
|
А |
|
А |
|
|
|
|
А |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
/ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
290 |
0.5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
А |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
210 |
230 |
250 |
270 |
290 нм |
210 |
230 |
250 |
270 |
290 нм |
ВЭЖХ - 2006
МЕТОДВЭЖХВСОВРЕМЕННОМ ОБЩЕСТВЕ
Количество
Важнейшие области применения ВЭЖХ контролируемых веществ
Контроль качества лекарств |
2000 |
Токсикология |
1000 |
Экология |
500 |
Химическая безопасность продовольствия |
500 |
Оборот наркотиков |
300 |
Фармакология |
100 |
|
|
77
ВЭЖХ - 2006
МЕТОДВЭЖХВСОВРЕМЕННОМ ОБЩЕСТВЕ
Аналитическаязадача: определитьконцентрациювещества N иззаданногоспискавеществ
Скрининг
ВЭЖХ - 2006
НЕДОСТАТКИ ВЭЖХ
Отсутствие"универсальных" методиканализа
Каждому веществу - своя "уникальная" методика
Калибровкахроматографапереданализом
Хроматограф - "черный" ящик
Многократноеповторениеанализа
Доверие только к усредненным результатам
78
ВЭЖХ - 2006
НЕДОСТАТКИ ВЭЖХ: фармакопейныйанализ
AMPICILLIN SODIUM
European Pharmacopoeia 1998:0578
Определение основного вещества и примесей:
-колонка 4.6х250 мм с обращенной фазой С18 (5 мкм)
-градиентное и изократическое элюирование (60 мин)
-УФ-детектированиепри λ=254 нм
ВЭЖХ - 2006
НЕДОСТАТКИ ВЭЖХ: фармакопейныйанализ
AMPICILLIN SODIUM
European Pharmacopoeia 1998:0578
1. Приготовление растворов:
элюент А: СН3СООН - 0.2 М КН2РО4 - ACN - Н2О = (0.5:50:50:899.5); элюент В: СН3СООН - 0.2 М КН2РО4 - ACN - Н2О = (0.5:50:400:549.5);
раствор 1: 31.0 мг субстанции в 50 мл элюента А; раствор 2: 31.0 мг субстанции в 10 мл элюента А;
раствор 3: 27.0 мг безводного ампициллина в 50 мл элюента А; раствор 4: 2.0 мг цефрадина в 50 мл элюента А; раствор 5: смесь 1 мл раствора 3 с 20 мл элюента А; раствор 6: смесь 1 мл раствора 5 с 25 мл элюента А; раствор 7: смесь 5 мл раствора 4 с 5 мл раствора №3; раствор 8: смесь 1 мл раствора 3 с 20 мл элюента А);
раствор 9: 200 мг субстанции в 1 мл воды гретьпри 60оС 1 час и смешатьсо 100 мл элюента А).
79