Барам_Курс лекций ВЭЖХ для ВСЕХ [2007]
.pdf
ВЭЖХ - 2006
ЭФФЕКТИВНОСТЬ, СЕЛЕКТИВНОСТЬ, РАЗДЕЛЕНИЕ
|
R |
=k1′ |
|
α2,1 −1 |
|
N |
|
|
s1, 2 |
2 |
|
k1′+k1′ α2,1 +2 |
|
|
|
RS1,2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
k'1=5 |
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
N=5000 |
|
k'1=2 |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
k'1=1 |
|
|
|
|
|
|
k'1=0.5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1.1 |
|
1.2 |
||
1.0 |
|
|
|
||||
|
|
|
|
α2,1 |
|
|
|
ВЭЖХ - 2006
РАЗРЕШЕНИЕПИКОВ
|
|
|
R |
= 2(Vr 2 −Vr1) |
|
|
||
|
|
|
s |
|
4σ1 + 4σ2 |
|
|
|
|
|
|
1,2 |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
S1=S2 (площади пиков вычислены в интервале ±4σ) |
|
||||||
Rs=0.5 (2σ) |
Rs=1.0 (4σ) |
|
Rs=1.2 (4.8σ) |
Rs=1.5 (6σ) |
|
|||
|
|
98% |
98% |
99.7% |
|
1 |
|
|
66% |
65% |
99.7% |
2 |
|
||||
|
|
|
|
|
100% |
100% |
||
20
ВЭЖХ - 2006
РАЗРЕШЕНИЕПИКОВ
|
|
R |
|
= 2(Vr 2 −Vr1) |
|
||
|
|
s |
|
4σ1 |
+ 4σ2 |
|
|
|
|
|
1,2 |
|
|||
|
|
|
|
|
|
||
Rs=1 (4σ) (площади пиков вычислены в интервале ±4σ) |
|||||||
SA/SB=1 |
A |
SA/SB=10 |
A |
SA/SB=100 |
A |
||
|
B |
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
97.7% |
|
97.7% |
|
99.8% |
|
100.0% |
|
|
|
|
|
|
B |
80.6% |
B |
|
|
|
|
|
|
70.7% |
|
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
|
|
ЭФФЕКТИВНОСТЬ |
|
|
||||
И СКОРОСТЬ |
|
H=B/U - вклад продольной диффузии |
||||
ПОТОКА |
|
(H) |
||||
|
|
|
||||
ЭЛЮЕНТА |
|
ВЭТТ |
H = A + B/U + CU |
|
||
|
уравнение |
|
||||
|
Ван-Деемтера |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Hмин |
|
|
|
H, |
|
|
|
|
|
H=CU - вклад массопереноса |
КОЛОНКА: 4х75 мм; силикагель (dp=4.2 мкм) |
|
H=A - вклад неоднородности упаковки |
||||
мкм |
|
|||||
ЭЛЮЕНТ: гептан |
|
|
|
|
||
40 |
|
о-Терфенил (k'=12) |
|
0 |
Uоптим |
Линейная скорость потока (U) |
30 |
|
|
|
|
|
|
20 |
|
Нитробензол (k'=4) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
0 |
4 |
8 |
12 |
|
|
|
|
|
U, мм/сек |
|
|
|
|
|
|
|
|
21 |
|
|
ВЭЖХ - 2006
ЭФФЕКТИВНОСТЬИ СКОРОСТЬ ПОТОКАЭЛЮЕНТАВUPLC
L=50 мм; элюент - H2O:CH3CN (30:70); аналит - гексилбензол
M.Kele et al., Waters Corp., 2004
ВЭЖХ - 2006
ЭФФЕКТИВНОСТЬИНАГРУЗКА НАКОЛОНКУ
Хроматография на силикагеле
ВЭТТ, мкм
10000 L.R.Snyder (1967)
8000
6000
4000
2000
0
10 |
100 |
1000 |
ВЭТТ, мкм
300 |
J.N.Done (1976) |
|
k'=5.9 |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
k'=0.9 |
200 |
|
|
|
k'=2.2 |
|
|
Область ВЭЖХ |
|
|
||
|
|
|
|
||
100 |
линейная хроматография |
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
0.01 |
0.1 |
1 |
10 |
100 |
1000 |
Нагрузка на адсорбент, мкг/г
22
ВЭЖХ - 2006
ДАВЛЕНИЕВВЭЖХ
P ≈21 F L η |
|
d p2 2 |
|
P - давление на входе в колонку, МПа F - скорость потока, мл/мин |
|
η - вязкость подвижной фазы, спз |
L - длина колонки, мм |
dp - диаметр частиц сорбента, мкм |
- диаметр колонки, мм |
Примеры вычисления:
1.=2 мм; L=75 мм; dp=5.0 мкм; η=1 спз; F=0.2 мл/мин; P≈3 МРа
2.=2 мм; L=75 мм; dp=1.7 мкм; η=1 спз; F=0.2 мл/мин; P≈26 МРа
3.=2 мм; L=75 мм; dp=1.7 мкм; η=1 спз; F=2.0 мл/мин; P≈275 МРа
ВЭЖХ - 2006
ВЯЗКОСТЬПОДВИЖНОЙФАЗЫ
Влияние температуры
Растворитель |
|
η (спз) при температуре, оС |
|
||||
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
||
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
Ацетонитрил |
0.396 |
0.357 |
0.325 |
- |
- |
- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Вода |
1.308 |
1.005 |
0.801 |
0.656 |
0.549 |
0.469 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Гексан |
0.343 |
0.307 |
0.290 |
0.253 |
0.248 |
0.222 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Метанол |
0.690 |
0.597 |
0.510 |
0.450 |
0.396 |
0.350 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Этанол |
1.466 |
1.200 |
1.003 |
0.834 |
0.702 |
0.592 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
23
ВЭЖХ - 2006
ВЯЗКОСТЬПОДВИЖНОЙФАЗЫ |
||||||
|
|
Водноорганические смеси |
||||
|
3 |
|
|
|
|
|
С) |
|
|
|
|
|
|
О |
|
|
|
|
|
|
25 |
2 |
|
|
|
|
- 1-Пропанол |
, сПз (при |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
- Этанол |
|
Вязкость |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
Вода |
|
|
|
- Метанол |
|
|
|
|
|
|
- Тетрагидрофуран |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
- Ацетонитрил |
|
0 |
|
|
|
|
|
|
0 |
20 |
40 |
60 |
80 |
100 |
|
Содержание органического растворителя, |
|||||
|
|
|
%(вес.) |
|
|
|
ВЭЖХ - 2006
ТЕМПЕРАТУРАВВЭЖХ
Изменение удерживания вещества
Термодинамические причины log k'=a/T + b
где
T - абсолютная температура (оК);
аи b - константы (обычно a>0).
Вобращенно-фазовой хроматографии "чувствительность"
удерживания в единицах k' при k' ≈10 составляет около 1 на 10оС.
Изменение конформации биомолекул
(белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды)
24
ВЭЖХ - 2006
ТЕМПЕРАТУРАВВЭЖХ
Изменение удерживания вещества
Разделение дезоксиолигонуклеотидов
Колонка: 2х250 мм
Сорбент: YMC ODS-AQ (dp=3 мкм) Элюент: 10 мМ ТЭААв 7% CH3CN
80° Скорость потока: 0.3 мл/мин Детектор: λ=260 нм
Образец: сумма pd(A)12-18 и pd(A)25-30
N.M.Djordjevic, F.Houdiere, P.Fowler, F.Natt. Anal. Chem., 1998, 70,1921-1925
60°
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
|
|
|
|
ТЕМПЕРАТУРАВВЭЖХ |
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|||
|
Изменение удерживания вещества |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
Полимеры (1000-9000 D), |
|
|
Т, °С |
||
|
|
|
содержащиеаминогруппы |
|
|
|
120 |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
90 |
||
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
60 |
||
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
30 |
||
|
|
|
|
|
||||
Колонка: 0.32 мм х 30 см с Hypersil ODS-100 (3 мкм)
Скорость потока: 5 мкл/мин
Элюент: этилацетат-CH3CN-(C2H5)3N-CH3COOH (45:44.9:10:0.1)
T.Andersen, I.L.Skuland, A.Holm, R.Trones, T.Greibrokk. J.Chromatogr. A, 2004, 1029, 49–56
25
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
ПИКОВАЯЕМКОСТЬКОЛОНКИ |
||||
Изократическое элюирование |
||||
Z = |
N |
|
1 + km′ |
|
|
ln |
|
− 1 |
|
|
4Rs |
|
1 + k1′ |
|
|
|
|
||
N=5000 Rs=1.2 k'1=0 k'm=5.3 |
||||
|
|
|
|
36 |
Объем |
|
|
|
100 |
|
|
|
Градиентное элюирование |
|
|
N=5000 Rs=1.2 VG=4000 мкл 4σ=60 мкл |
|||
|
|
|
|
64 |
|
|
|
|
[Б],% |
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
Объем |
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
ПИКОВАЯЕМКОСТЬКОЛОНКИ |
||||
Колонка: 0.05х1500 мм с фазой Phenomenex C18 (30 нм, 3 мкм)
Скорость потока: 0.15 мкл/мин Давление: 115 МПа
Образец: триптический гидролизат 20 мкг белка
M.-S. Kim, W.-S. Choie, Y.S. Shin, M.-H. Yu, S-.W. Lee.
Bull. Korean Chem. Soc. 2004, Vol. 25, No. 12, 1833-1839.
26
ВЭЖХ - 2006
КОЛОНКИВВЭЖХ
Относительный объем
0.1 |
4.6х250 мм |
0.5 |
2х250 мм |
Относительнпя |
концентрация |
0 |
|
0 |
|
0 |
17.6 |
0 |
3.3 |
0.3 |
|
4.6х75 мм |
1.0 |
2х75 мм |
|
0 |
|
0 |
|
0 |
5.3 |
0 |
1 |
ВЭЖХ - 2006
КОЛОНКИВВЭЖХ
Колонка, |
N, |
P, |
|
k'=10 |
|
мм |
т.т. |
отн. |
VR, отн. |
TR, отн. |
h, отн. |
250х4.6 |
20000 |
3 |
17.6 |
3 |
0.1 |
250x2 |
20000 |
3 |
3.3 |
3 |
0.5 |
75x4.6 |
6000 |
1 |
5.3 |
1 |
0.3 |
75x2 |
6000 |
1 |
1 |
1 |
1 |
МИКРОКОЛОНОЧНАЯ И ОБЫЧНАЯ ВЭЖХ
|
МК ВЭЖХ |
ВЭЖХ |
|
|
|
|
|
|
Размеры колонки, мм |
2х60÷80 |
4.6х250 |
Эффективность колонки, т.т. |
5000÷6000 |
15000÷20000 |
Пиковая емкость колонки, пики* |
40÷45 |
70÷85 |
Линейная скорость элюции, мм/сек |
0.5÷1 |
1÷2 |
Объемная скорость элюции, мл/мин |
0.1÷0.2 |
1÷2 |
Рабочее давление, МПа |
2÷4 |
15÷30 |
Расход элюента на 1 анализ, мл** |
2 |
40 |
Время анализа, мин** |
10÷20 |
20÷40 |
27
ВЭЖХ - 2006
КОЛОНКИВВЭЖХ
Классификация ВЭЖХ по диаметру колонок
Тип хроматографии |
внутр, мм |
|
Обычная ВЭЖХ |
3-5 |
|
Conventional HPLC |
||
|
||
ВЭЖХ на узких колонках |
2 |
|
Narrow-bore HPLC |
||
|
||
Микроколоночная ЖХ |
0.5-1 |
|
Micro LC |
||
|
||
Капиллярная ВЭЖХ |
0.1-0.5 |
|
Capillary LC |
||
|
||
Нано ВЭЖХ |
0.01-0.1 |
|
Nano LC |
||
|
||
ВЭЖХ на полом каилляре |
0.005-0.05 |
|
Open tubular LC |
|
Y.Saito, K.Jinno, T.Greibrokk. J. Sep. Sci. 2004, 27, 1379–1390
28
Лекция 3
Механизмы жидкостной хроматографии
Г.И.Барам Курс лекций "ВЭЖХ для ВСЕХ"
Новосибирск, 2007
29