Барам_Курс лекций ВЭЖХ для ВСЕХ [2007]
.pdf
ВЭЖХ - 2006
КАКИЕБЫВАЮТХРОМАТОГРАФЫ?
БИОХРОМАТОГРАФЫ
ВЭЖХ - 2006
КАКИЕБЫВАЮТХРОМАТОГРАФЫ?
ПОЛЕВЫЕ ХРОМАТОГРАФЫ
10
ВЭЖХ - 2006 |
КАКИЕБЫВАЮТХРОМАТОГРАФЫ? |
ПОЛЕВЫЕ ХРОМАТОГРАФЫ |
Милихром А-02 |
"EnviroChrom", 1995 г. |
ЗАО "ЭкоНова" (Новосибирск), "KNAUER, GmbH" (Берлин) |
"Милихром А-02", 1996 г. |
ЗАО "ЭкоНова" (г. Новосибирск) и АО "БЭМЗ" (г.Бердск) |
ВЭЖХ - 2006 |
ПРИКЛАДНАЯ АНАЛИТИЧЕСКАЯ |
ХРОМАТОГРАФИЯ В РФ(2004 г.) |
ОБЛАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ |
1. |
ЭКУ МВД |
9. |
Лаборатория охраны природы |
2. |
ЭКУ ФСКН |
10. |
Агрохимическая лаборатория |
3. |
Криминалистическая лаборатория ФСБ |
11. |
Лаборатория Госгидромета |
4. |
Лаборатория МЧС |
12. |
Лаборатория Облэнерго |
5. |
Пищевая лаборатория Санэпидемнадзора |
13. |
Лаборатория Судмедэкспертизы |
6. |
Ветеринарная лаборатория |
14. |
Лаборатория Водоканала |
7. |
Пищевая лаборатория Госстандарта |
15. |
Лаборатория наркологии |
8. |
Фармацевтическая лаборатория Облздрава |
16. |
Лаборатории Областных больниц |
ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ ЛАБОРАТОРИИ
1. |
Фармацевтические заводы |
7. |
Заводы безалкагольных напитков |
2. |
Ликеро-водочные заводы |
8. |
Масложиркомбинаты |
3. Мясокомбинаты |
9. |
Птицефабрики |
|
4. |
Витаминные заводы |
10. |
Химические заводы (пестициды, красители) и пр.) |
5. |
Теплоэлектростанции |
11. |
Алюминиевые заводы |
6. |
Нефтеперерабатывающие заводы |
12. |
Кондитерские фабрики |
ПРОЧИЕ ЛАБОРАТОРИИ
Наука, Высшие учебные заведения, Армия, Таможня
11
Лекция 2
Терминология ВЭЖХ. Формальная колоночная хроматография.
Г.И.Барам Курс лекций "ВЭЖХ для ВСЕХ"
Новосибирск, 2007
12
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ ПИК |
||
1 |
|
2 |
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
1 |
2 |
|
3 |
|
Y |
Y |
Y |
|
1 |
2 |
3 |
X |
X |
|
X |
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ ПИК |
||
|
|
|
TR |
|
ВРЕМЯ (T) |
C |
h - высота пика |
|
|
Вершина пика |
|
|
|
|
|||
вещества, |
|
|
|
||
0.607h |
|
|
2σ |
Задний фронт |
|
Концентрация |
Передний фронт |
|
|
|
|
0.5h |
|
w |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
2.345σ |
|
|
0.135h |
|
|
4σ |
|
|
10%h |
|
a b |
Основание пика |
|
|
0 |
VR |
|
4σ |
ОБЪЕМ (V) |
|
W |
|
|
||
|
|
|
|
|
|
VR - объем удерживания вещества TR - время удерживания вещества σ - дисперсия гауссова пика
h - высота гауссова пика S - площадь гауссова пика
|
|
1 |
|
|
|
x |
2 |
||||
y = |
|
e |
|
|
2σ |
|
|||||
|
|
|
− |
|
|
|
|||||
|
σ |
2π |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
V |
−Vr 2 |
|||||||
C (V )= h e |
−0.5 |
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
σ |
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
T −Tr |
2 |
||||||
|
|
|
−0.5 |
|
|
|
|
|
|
||
C (T )= h e |
|
σ |
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
h = σ S2π
13
ВЭЖХ - 2006
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ ПИК |
||||||
|
|
|
TR |
|
ВРЕМЯ (T) |
|
C |
h - высота пика |
|
|
Вершина пика |
||
|
|
|
||||
вещества, |
|
|
|
|||
Передний фронт |
|
|
Задний фронт |
|||
|
|
|
||||
0.607h |
|
|
2σ |
|
||
Концентрация |
0.5h |
w |
|
|
|
|
|
|
|
2.345σ |
|||
0.135h |
A |
4σ |
|
|||
|
|
|
||||
10%h |
a |
b |
Основание пика |
|||
|
||||||
|
0 |
VR |
|
4σ |
ОБЪЕМ (V) |
|
|
W |
|
|
|||
|
|
|
|
|
||
А10%h=b10%h/a10%h - асиметрия пика на уровне 10%h |
||||||
AS=w5%h/2a5%h - асиметрия пика на уровне 5%h (Британская и Европейская Фармакопеи)
ВЭЖХ - 2006
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ ПИК |
||||||
|
|
|
TR |
|
ВРЕМЯ (T) |
|
C |
h - высота пика |
|
|
|
Вершина пика |
|
|
|
|
|
|||
вещества, |
|
|
|
|
||
Передний фронт |
|
|
|
Задний фронт |
||
|
|
|
|
|||
0.607h |
|
|
|
2σ |
|
|
Концентрация |
0.5h |
|
w |
|
|
|
|
|
|
|
2.345σ |
||
0.135h |
|
A |
|
4σ |
|
|
|
|
|
|
|||
10%h |
|
a |
b |
Основание пика |
||
|
|
|||||
|
0 |
VR |
|
|
4σ |
ОБЪЕМ (V) |
|
W |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
N=(V /σ)2≈5.54(V /w)2≈16(V /W)2 |
- эффективность колонки |
|||||
R |
R |
|
R |
|
(число теоретических тарелок) |
|
|
|
|
|
|
||
H=L/N - высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ), где L- длина колонки
14
ВЭЖХ - 2006
ХРОМАТОГРАММА
Хроматограмма - кривая, отображающая зависимость величины концентрации вещества в вытекающей из колонки подвижной фазе от объема вытекшей фазы или от времени
С |
Te |
T0 |
TR |
ВРЕМЯ (T) |
|
|
Область |
|
|
|
|
Область |
|
|
|
|
адсорбционной и |
||
|
|
эксклюзионной |
||
|
|
распределительной |
||
|
|
хроматографии |
||
|
|
хроматографии |
||
|
|
|
||
0 |
Ve |
V0 |
VR |
ОБЪЕМ (V) |
Ve (Te) - исключенный объем (время) колонки; равен объему подвижной фазы, находящейся снаружи зерен пористой стационарной фазы
V0 (T0) - свободный или мертвый объем (время) колонки; равен полному объему находящейся в колонке подвижной фазы (объем удерживания несорбируемого вещества)
VR (TR) - объем (время) удерживания вещества
|
ОБЪЕМ и ВРЕМЯ |
F - объемная cкорость потока подвижной фазы |
|
U - линейная скорость потока подвижной фазы вдоль колонки |
|
s - площадь сечения колонки |
|
V=FT |
Vr=FTr V0=FT0 U=F/s T0=L/U |
ВЭЖХ - 2006
|
ХРОМАТОГРАММА |
|
||
|
Удерживание вещества |
|
||
|
Te |
T0 |
TR |
ВРЕМЯ (T) |
С |
|
|
Область |
|
|
|
Область |
|
|
|
|
адсорбционной и |
||
|
|
эксклюзионной |
||
|
|
распределительной |
||
|
|
хроматографии |
||
|
|
хроматографии |
||
|
|
|
||
0 |
Ve |
V0 |
VR |
ОБЪЕМ (V) |
VR=V0+V0·k'
k' - фактор удерживания вещества (емкостное отношение)
α1,2=k'2/k'1 - фактор разделения веществ 1 и 2 (селективность)
15
ВЭЖХ - 2006
ХРОМАТОГРАММА
Разделение пиков
T1 |
T2 |
ВРЕМЯ (T) |
С
0 V1 V2 ОБЪЕМ (V)
R |
= |
2(Vr 2 −Vr1 ) |
= |
2 Vr |
≈ Vr |
|
|
||||
s |
|
W1 +W2 |
|
4σ1 + 4σ2 |
4σ |
|
|
|
разрешение пиков 1 и 2
ВЭЖХ - 2006
ЭФФЕКТИВНОСТЬИСЕЛЕКТИВНОСТЬ
Низкая эффективность |
Высокая эффективность |
|
Низкая селективность |
Низкая селективность |
|
A |
B |
1 2 |
1+2 |
|
3 |
|
|
|
3 |
|
|
α1,2=1.1 |
α1,2=1.1 |
|
N=1000 |
|
|
N=5000 |
|
|
|
|
|
Низкая эффективность Высокая селективность
C
1
2 3
α1,2=1.5 N=1000
Высокая эффективность Высокая селективность
D |
1 |
2 |
3
α1,2=1.5 N=5000
16
ВЭЖХ - 2006
ЭФФЕКТИВНОСТЬ + СЕЛЕКТИВНОСТЬ
HPLC
High
Performance (Pressure, Performance, Pleasure, P...)
Liquid
Chromatography
HRLC™ -High Resolution Liquid Chromatography (Bio-Rad Lab.)
FPLC™ - Fast Polymer (Peptide, Protein, Polynucleotide) Liquid Chromatography
(Pharmacia)
UPLC™ - Ultra Performance Liquid Chromatography (Waters Corp., 2004)
Ultra Pressure Liquid Chromatography (P≥1000 атм)
ВЭЖХ
ВысокоЭффективная Жидкостная Хроматография
Cовременная ВЭЖХ - 1 вещество/мин
ВЭЖХ - 2006
ФОРМА ПИКА
|
Молекулы образца |
Инжекция |
в растворе |
|
1
Теоретические 23 
КОЛОНКА тарелки 4 
5 
17
ВЭЖХ - 2006
ФОРМА ПИКА(1)
k'=1; N=5
Теоретические |
1 |
|
Инжекция |
2 |
|
|
|
тарелки |
3 |
|
|
4 |
|
|
|
|
5 |
|
|
|
|
Равновесие |
|
Адсорбированные |
|
|
Свободные |
(неподвижные) |
|
|
(подвижные) |
молекулы |
|
Элюция |
молекулы |
|
|
|
Равновесие
Элюция
Равновесие
Элюция
Равновесие
Элюция
Равновесие
ВЭЖХ - 2006
ФОРМА ПИКА(2)
k'=1; N=5
Хроматограмма
Элюция
Равновесие |
Элюция |
|
|
Элюция |
Элюция |
Равновесие |
|
Элюция |
Элюция |
Равновесие |
|
Элюция |
Элюция |
Равновесие |
|
Элюция |
Элюция |
Равновесие |
|
Элюция |
Элюция |
Равновесие |
|
Элюция |
Элюция |
Равновесие |
|
Элюция |
Элюция |
Равновесие |
|
Элюция |
Элюция |
Равновесие |
|
Элюция |
Элюция |
Равновесие |
|
Элюция |
Элюция |
18
ВЭЖХ - 2006
ЭФФЕКТИВНОСТЬ, СЕЛЕКТИВНОСТЬ, РАЗДЕЛЕНИЕ
R = |
k′ |
|
α2,1 |
−1 |
N |
1 |
|
|
|||
s |
2 |
|
k1′ +k1′ α2,1 + 2 |
|
|
1,2 |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
N, |
|
|
|
|
k'1=0.5 |
т.т. |
|
|
|
|
|
5000 |
|
|
|
|
|
4000 |
|
|
α2,1=1.15 |
|
|
|
|
|
|
||
3000 |
|
|
|
|
k'1=1 |
|
|
|
|
|
|
2000
k'1=2
1000
k'1=5
0
0 |
0.5 |
1.0 |
1.5 |
2.0 |
2.5 |
3.0 |
RS1,2
ВЭЖХ - 2006
ЭФФЕКТИВНОСТЬ, СЕЛЕКТИВНОСТЬ, РАЗДЕЛЕНИЕ
|
R =k1′ |
|
α2 ,1 −1 |
|
N |
||
|
s1 ,2 |
2 |
|
k1′ +k1′ α2 ,1 +2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
N, |
|
|
|
|
|
|
|
т.т. |
|
|
|
|
|
|
|
5000 |
|
|
|
|
|
|
|
4000 |
k'1=0.5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
RS1,2=1 |
|
|
|
|
3000 |
|
|
|
|
|
|
|
k'1=1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2000 |
k'1=2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1000 |
k'1=5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1.1 α2,1 |
|
|
|
|
1.0 |
|
|
1.2 |
1.3 |
|||
19