Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Барам_Курс лекций ВЭЖХ для ВСЕХ [2007]

.pdf
Скачиваний:
120
Добавлен:
29.06.2020
Размер:
4.17 Mб
Скачать

ВЭЖХ - 2006

ХРОМАТОГРАФИЯИОНОВ

 

 

 

 

 

 

НАОБРАЩЕНОЙФАЗЕ

 

 

 

Слабые кислоты и основания

 

 

R COOH R COO+ H +

R N +H3 R NH2 + H +

Ka =

[R COO] [H + ]

K

a

=

[R NH2 ] [H + ]

[R COOH ]

[R N

+H3

]

 

 

 

 

R-COOH

 

 

R-NH2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

+

 

 

 

 

 

 

 

R-NH3

 

 

 

 

 

 

 

k'

 

 

 

 

 

 

 

рКа

 

 

R-COO

 

 

 

рН раствора

 

 

 

 

 

 

ВЭЖХ - 2006

 

 

 

 

 

 

 

СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ"С18"

 

 

химическая дериватизация

 

 

Производные аминокислот:

с фенилизотиоцианатом (ФТК-АК)

H S H COOH

N C N C R

H

с орто-фталевым альдегидом (ОФА-АК)

S CH2CH2OH

COOH

N C R

H

40

ВЭЖХ - 2006

 

 

 

 

 

СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ "С18"

Порядок элюирования производных аминокислот

из колонок с обращенной фазой

 

Аминокислота

Код

Структура радикала R

ФТК-АК

ОФА-АК

Аспарагиновая кислота

Asp

CH2COO

1

1

Глутаминовая кислота

Glu

CH2CH2COO

2

2

Серин

Ser

CH2OH

 

3

3

Глицин

Gly

H

 

4

7

Гистидин

His

NH

5

4

CH2

 

Треонин

Thr

N

 

6

6

CHOHCH3

Аланин

Ala

CH3

 

7

9

Аргинин

Arg

CH2 (CH2)2 N

C NH

8

5

H NH2

 

 

 

 

Тирозин

Tyr

CH2

OH

9

8

Валин

Val

CH(CH3)2

10

11

Метионин

Met

CH2CH2SCH3

11

10

Изолейцин

Ile

CHCH3CH2CH3

12

13

Лейцин

Leu

CH2CH(CH3)2

13

14

Фенилаланин

Phe

CH2

 

14

12

ВЭЖХ - 2006

 

 

 

 

 

СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ "С18"

Предсказание удерживания сложных молекул: пептиды

N-конец

 

 

Пептидная связь

 

 

 

 

 

С-конец

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

H

 

 

 

 

O

 

H

H2N

 

 

CH

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

...

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

C

 

N

 

 

CH

 

 

 

CH

 

C

 

N

 

CH

 

COOH

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

R1

 

 

 

 

R2

 

R3

 

 

 

 

R4

Остатки аминокислот

VR f(Zi, V0)

Zi - вклад i-того структурного элемента пептида в его удерживание

41

ВЭЖХ - 2006

СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ "С18"

Предсказание удерживания пептидов

Структурный

Код

Объем,

 

элемент пептида

мкл

 

 

 

VR

Zi

 

Asn

N

162

0

 

Ser

S

164

0

 

Asp

D

164

0

 

Gln

Q

165

0

 

Gly

G

170

5

 

His

H

175

10

 

Glu

E

177

12

мкл

Thr

T

180

15

Lys

K

182

17

выч.),

Cys

C

244

79

Ala

A

183

18

 

 

 

 

 

R

Arg

R

196

31

 

 

 

 

(

 

 

 

 

V

Pro

P

215

50

 

Val

V

309

144

 

Met

M

354

189

 

Tyr

Y

512

347

 

Ile

I

643

478

 

Leu

L

686

521

 

Phe

F

811

646

 

Trp

W

1029

864

 

[(-СOOH) + (-NH2)]end

CN

-

15

 

VR = 209 · [(Σ Zi) + ZCN + V0]1/3 - 990

3000

30 пептидов

2500

2000

1500

1000

500

0

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

VR (эксп.), мкл

Азарова И.Н., Барам Г.И., Гольдберг Е.Л. Биоорган. химия, 2005, впечати

ВЭЖХ - 2006

СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ "С18"

Предсказание удерживания пептидов

Оптическоепоглощение

Вычислено

6

24

 

 

 

А210

 

 

 

 

 

А220

 

 

18

 

 

 

 

 

 

 

А230

 

21

 

 

 

А280

13

27

2

 

 

4

5

 

 

 

 

 

 

30

 

 

 

 

 

Эксперимент

 

21

 

 

 

 

6

 

24

 

 

 

 

 

 

 

5

13

18

27

 

4

 

2

 

 

 

 

30

0

400

800

1200

1600

2000

2400

2800

Объем, мкл

Азарова И.Н., Барам Г.И., Гольдберг Е.Л. Биоорган. химия, 2005, впечати

42

ВЭЖХ - 2006

ХРОМАТОГРАФИЯИОНОВ

НАОБРАЩЕННОЙФАЗЕ

Ион-парная хроматография

 

 

 

 

 

_

O

 

 

H3N+R

 

 

O C R

O

 

 

CH3

_

O

 

H2N+(R)2

 

 

 

 

S

O-

HN+(R)3

 

N+ CH3

O P O R

O

 

N+(R)4

 

CH3

 

O

 

 

_

O

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O S R

 

 

 

 

 

 

O

 

КОНКУРЕНТЫ

 

 

 

 

+

 

 

+

+

Ионообменный

 

Катионы

 

механизм

 

 

 

 

 

Анионы

 

 

 

 

+

 

 

+

+

Гидрофобный

Гидрофобные

 

механизм

молекулы

43

Лекция 4

Неподвижные фазы для колоночной жидкостной

хроматографии

Г.И.Барам Курс лекций "ВЭЖХ для ВСЕХ"

Новосибирск, 2007

44

ВЭЖХ - 2006

НЕПОДВИЖНЫЕФАЗЫДЛЯВЭЖХ

Механическая прочность

Мягкие фазы

на основе целлюлозы, декстрана, полиакриламида, полистирола и др. для колоночной ЖХ низкого давления

(Рмакс<0.2 МПа)

Полужесткие фазы

на основе поливинилового спирта, полистирола для ВЭЖХ на коротких колонках (Рмакс до 10 МПа)

Жесткие фазы

на основе окисей кремния, алюминия, циркония, стекла

(Рмакс до 50 МПа).

ВЭЖХ - 2006

НЕПОДВИЖНЫЕФАЗЫДЛЯВЭЖХ

Форма частиц

- сферическая

- неправильная

- неправильная (скругленная)

45

ВЭЖХ - 2006

НЕПОДВИЖНЫЕФАЗЫДЛЯВЭЖХ

Площадь поверхности

непористая фаза

"открытая" колонка

поверхностно-пористая (pellicular) фаза

объемно-пористая фаза Zorbax® (DuPont)

ВЭЖХ - 2006

НЕПОДВИЖНЫЕФАЗЫДЛЯВЭЖХ

Площадь поверхности

перффузионная

монолитная

фаза

колонка

поликапиллярная

поливолоконная

колонка

колонка

Y. Saito et al. Anal. Chem., 2003, 75, 5525–5531

R.K. Marcus et al. J. Chromatogr. A, 2003, 986, 17–31.

46

ВЭЖХ - 2006

НЕПОДВИЖНЫЕФАЗЫДЛЯВЭЖХ

Распределение частиц и пор по размеру

1

B

 

100%

Интегралраспределения

Нормированное распределение Гаусса

A

90%

80

 

 

 

 

50%

60

 

 

 

 

40

 

10%

20

 

 

 

 

0

0

 

 

 

 

d10% d50% d90%

 

 

 

 

Размер частиц или пор

 

 

ВЭЖХ - 2006

НЕПОДВИЖНЫЕФАЗЫДЛЯВЭЖХ

Соотношение размеров

 

Бактерия

Частица адсорбента

Вирус

dp=5 мкм

 

0

2

4 мкм

 

 

 

Масштаб

47

ВЭЖХ - 2006

АДСОРБЕНТЫДЛЯВЭЖХ

Синтез объемно-пористого силикагеля

Na SiO + H O H+ xSiO yH O

2 3 2 2 2

Si(OC H ) + H O H+ xSiO yH O

2 5 4 2 2 2

O

O Si OH

O

O Si OH

O

Силанольные группы

Типичный

силикагель для ВЭЖХ

концентрация силанолов: 7-8 мкмоль/м2 размер частиц: 3, 5±1, 7, 10 диаметр пор: 10±2 нм удельная поверхность: 300 м2удельный объем пор: 0.8 мл/г

Nucleosil 100-5, LiChrosorb Si 60, LiChrospher Si 100, Zorbax BP-Sil и т.д.

ВЭЖХ - 2006

АДСОРБЕНТЫДЛЯВЭЖХ

Синтез объемно-пористого силикагеля Технология Zorbax®

48

ВЭЖХ - 2006

АДСОРБЕНТЫДЛЯВЭЖХ

Синтез объемно-пористого силикагеля:

технология ACQUITY UPLC (Waters)

BEH:

Bridged

Ethyl-siloxane

Hybrid

ВЭЖХ - 2006

АДСОРБЕНТЫДЛЯВЭЖХ

Синтез привитых мономерных фаз

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

CH3

 

 

 

 

O

 

Si

 

 

OH

 

 

 

 

 

 

 

O

 

Si

 

 

O

 

 

Si

 

 

R

 

CH3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

CH3

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

CH3

 

O

 

Si

 

 

OH + Cl

 

Si

 

R

 

 

 

O

 

Si

 

 

OH + Cl

 

Si

 

CH3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

- HCl

 

 

 

 

 

O

 

CH3

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

CH3

 

CH3

O

 

Si

 

OH

 

 

 

 

 

 

 

O

 

Si

 

O

 

Si

 

R

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

 

 

 

CH3

 

 

 

 

O CH3

O Si O Si R

OCH3

-HClO Si O Si (CH3)3

OCH3

O Si O Si R

O CH3

Присоединение функциональной

Инактивация оставшихся

группы R

силанолов ("endcapping")

49