Бёккер_Хроматография [2009]

60 Глава 3. Газовая хроматография

Если мысленно разделить хроматографическую колонку на множество неболь& ших отрезков и представить себе разделение многокомпонентной смеси, то про& цесс распределения происходит на каждой ступени. Каждое вещество имеет от& личное от других время удерживания стационарной фазой. Этот эффект обуслов& лен молекулярным весом сорбата, формой его молекулы и наличием в его струк& туре функциональных групп. Даже если времена удерживания отличаются мало, то вещества разделяются благодаря многократному повторению процесса распре& деления. В результате вещества отделяются друг от друга, и каждое вещество за& нимает в колонке определенное место. Чем длиннее колонка, тем лучше разделе& ние. Предельная длина колонки определяется сопротивлением потока подвиж& ной фазы, и разделяющая способность растет пропорционально квадратному кор& ню из длины колонки. Отсюда можно сделать вывод, что в колонке для каждого количества пробы должно присутствовать определенное количество стационар& ной фазы и что, соответственно, нельзя перегружать колонку.

3.2. Система подачи газа

Обычно в качестве газа&носителя используется высокоочищенный азот, поставля& емый обычно в стальных баллонах. Если хотят проводить хроматографию высоко& го разрешения, то к чистоте газа предъявляются особенно высокие требования. Газ& носитель не должен содержать кислород (<0,1 ppm). В противном случае при высо& ких температурах жидкая фаза будет разлагается и время жизни колонки сильно сокращается. Даже следов кислорода, которые диффундируют через малейшие не& плотности в резиновых прокладках, достаточно, чтобы вызвать быструю химичес& кую деструкцию стационарной фазы. Эта реакция особенно ускоряется при высо& кой температуре, что может привести к сильному фону базовой линии.

Следы воды могут легко гидролизовать жидкую фазу. Углеводороды уже в ко& личестве около 1 ppm вызывают сильный дрейф базовой линии, когда использу& ется ПИД. Примеси также привносятся из полимерной мембраны в редукторе или из полимерного шланга. Таким образом, рекомендуется использование спе& циального регулятора давления с металлическими мембранами и металлических подводящих капилляров. Совершенно очевидно, что здесь необходим также мик& ропроцессор. Подача газа, до сих пор осуществлявшаяся механическим регулято& ром, может управляться электроникой. Лишь очень немного приборов использу& ет сегодня игольчатый вентиль как «регулятор подачи газа». Температурный дрейф, которому подвержен также и механический регулятор, устраняют путем термо& статирования всего пневматического блока. Известно, что постоянство потока газа позволяет поддерживать в оптимуме как разделяющую способность капил& лярной колонки, так и чувствительность детектора, что является необходимым условием ГХ высокого разрешения. На смену механическим регуляторам прихо& дят электронные, снабженные электрическими сенсорами. Эти устройства позво& ляют электрически регулировать потоки газа&носителя в ГХ и выводить показа& ния на цифровое табло.

Пневматика заботится о том, чтобы в линию поступал поток газа с заданными параметрами. Современные регуляторы потока газа являются диффузионно непро&

ницаемыми и защищают газ&носитель от кислорода. Резиновые мембраны в редук& торах проницаемы и, кроме того, они привносят в поток газа значительное количе& ство пластификатора. Кислород при повышенных температурах изменяет поляр& ность фазы, пластификаторы вызывают появление ложных пиков. Свойства высо& кокачественного регулятора давления с металлической мембраной гарантируют количественную воспроизводимость анализа. Газовая хроматография с игольчатым вентилем в системе подачи газа не годится для количественного анализа.

Электронное управление является условием полного контроля газовых хро& матографов. Оно открывает также путь к полностью автоматической оптимиза& ции. Оптимизация вручную редко осуществляется в полном объеме, хотя извест& но, что капиллярные колонки необходимо оптимизировать либо по разделяющей способности (максимум разрешения), либо по максимальной производительнос& ти (максимальное число пиков/мин), варьируя скорость потока газа&носителя.

3.2.1. Поток газа(носителя

Поток газа&носителя влияет на скорость переноса веществ по колонке. Эффектив& ность колонки уменьшается при увеличении линейной скорости потока газа&носи& теля, поскольку ухудшается массообмен между подвижной и стационарной фазами (уширение пиков). С другой стороны, уширение пиков вследствие диффузии ком& понентов в подвижной фазе уменьшается при высоких скоростях потоков.

Поэтому скорость потока газа&носителя является тем параметром, который необходимо оптимизировать для достижения оптимальных условий работы ко& лонки. Цель оптимизации потока состоит в том, чтобы при данных свойствах ко& лонки, данной температуре колонки и выбранном газе&носителе определить та& кую скорость потока, которая или обеспечит максимальное число тарелок, не об& ращая при этом внимание на время проведения анализа, или, при еще макси& мально возможном разделении, позволит провести анализ в самое короткое время.

У капиллярных колонок скорость потока составляет лишь несколько милли& литров в минуту. Поэтому его измерение на выходе из колонки затруднено. К тому же, в зависимости от условий на выходе колонки находится детектор и/или пода& ются дополнительные потоки газа.

Простой и доступный метод для определения скорости потока газа&носителя состоит в хроматографировании вещества, которое не взаимодействует со стацио& нарной фазой. По времени удерживания наблюдаемых пиков можно рассчитать как объемную скорость потока в мл/мин, так и среднюю линейную скорость потока в см/с. В качестве летучего компонента рекомендуется использовать, например, ме& тан (его температура кипения –161,4 °С). Для колонок с толстым слоем стационар& ной фазы при низких температурах взаимодействия могут все же присутствовать. В этом случае определения нужно проводить при повышенных температурах. Сле& дующие уравнения служат для расчета средней линейной скорости газа&носителя:

u = l/t0,

где u – средняя линейная скорость газа&носителя; l – длина колонки; t0 – время удерживания стандарта.

62 Глава 3. Газовая хроматография

Объемную скорость потока газа&носителя можно найти с помощью следую& щего уравнения. Она необходима для точного определения отношения деления потока при вводе пробы с делением потока:

F = π r 2 l , t0

где F – объемная скорость потока в мл/мин; r – радиус колонки.

3.2.2. Работа с хроматографическими колонками

Заполненные колонки применяют в сочетании с регуляторами потока, которые позволяют получить постоянный, независимый от сопротивления колонки по& ток газа&носителя. Использование капиллярных колонок требует регуляторов дав& ления, которые обеспечивают постоянное и не зависящее от вязкости газа давле& ние на входе в колонку. Точную величину объемной скорости потока можно из& мерить с помощью объемного расходомера на конце колонке при постоянной тем& пературе термостата.

В отличие от заполненных колонок, оптимизация эффективности разделения капиллярных колонок проводится на основе линейной скорости газа&носителя u. Она является важнейшим параметром для достижения оптимальных условий эк& сплуатации колонки.

Высокая воспроизводимость времен удерживания, также как и стабильность сигнала детектора, зависят от постоянства потока газа&носителя и принципиаль& но достигаются путем добавления регулятора давления или потока.

3.2.2.1. Регулятор давления

Регулятор давления является относительно простым устройством и представ& лен на рис. 3.1. Он обеспечивает постоянное установившееся давление на выхо& де, которое, конечно, зависит от давления на входе. Газ поступает в нижнюю камеру и поступает через клапан в верхнюю камеру и далее на выход. Положе& ние клапана контролируется силой, с которой пружина действует на мембрану

Рис. 3.1. Устройство регулятора давления

64 Глава 3. Газовая хроматография

Рис. 3.3. Искажение сигнала детектора вследствие пульсации давления при вводе газовой пробы

Регулятор потока обладает все же некоторыми недостатками:

•игольчатый вентиль в регуляторе подвержен сильному влиянию темпера& туры и поэтому должен термостатироваться;

•любая, даже небольшая неплотность не будет учитываться регулятором, так что объемный поток будет делиться между колонкой и неплотностью, что приведет к уменьшению потока через колонку;

•реакция такого регулятора является относительно медленной. В анализе га& зов очень важно, чтобы возникающая при подаче пробы в поток газа&носи& теля пульсация давления быстро выравнивалась. С медленным регулятором потока это невозможно, что приводит к искажению формы сигнала детектора.

Регулятор давления реагирует намного быстрее и поэтому у него этот недо& статок не наблюдается. Этот эффект показан на рис. 3.3.

В системах с переключением колонок часто появляются значительные пере& пады давления, к примеру, при отключении колонки или подключении обходно& го капилляра (bypass). Эти помехи можно уменьшить, если для выравнивания дав& ления использовать регулятор давления и игольчатый вентиль (рестрикторы).

3.3. Колонки для газовой хроматографии

Как уже упоминалось вначале, разделяющие колонки являются сердцем газового хроматографа. Здесь компоненты пробы разделяются соответственно полярнос& ти и разделяющей способности колонки. Существуют самые различные типы ко& лонок, чтобы удовлетворить изменяющиеся требования анализа. Общими харак& теристиками хороших хроматографических колонок являются:

•хороший массообмен между подвижной и стационарной фазами,

•высокая проницаемость, то есть низкий перепад давления для данного по& тока газа&носителя,

•высокая емкость колонки,

•широкий температурный интервал применения, то есть возможность рабо& ты при высоких температурах.

На практике применяются два совершенно разных типа разделительных ко& лонок:

•заполненные колонки и

•капиллярные колонки.

В современной газовой хроматографии используют почти исключительно ка& пиллярные колонки. Даже ряд критических разделений, таких как препаратив& ная газовая хроматография, может проводиться на капиллярных колонках после появления колонок сверхбольшого диаметра (англ. «Megabore»).

Возросшие требования к пределам обнаружения веществ, так же как и требо& вания к разделения изомеров, например, при анализе ПХБ (полихлорбензолов) или диоксинов, могут быть выполнены только на капиллярных колонках. К со& жалению, это обстоятельство еще не получило повсеместного признания, напри& мер, в области законодательно регламентированных анализов, где и сегодня еще многие аналитические методы американской службы защиты окружающей сре& ды основываются на применении наполненных колонок.

3.3.1. Наполненные колонки

Сорбент, который наряду с большой поверхностью должен быть не слишком мел& козернистым и иметь, по возможности, однородное распределение частиц по раз& мерам, заполняют в трубки из нержавеющей стали или стекла с диаметром внут& реннего сечения от 1 до 5 мм и длиной от 0,5 до 10 м таким образом, чтобы наполне& ние получилась гомогенным и при этом не происходило разрушения частиц. Диа& метр частиц пористого сорбента лежит обычно между 50 и 500 мкм. С уменьшением диаметра частиц возрастает сопротивление потоку подвижной фазы на колонке. Чтобы получить эффективные колонки и в то же время избежать слишком большо& го противодавления, преимущественно используются узкие фракции сорбентов зернением между 100 и 300 мкм.

Пористый материал обладает большой поверхностью, разделение на которой происходит либо непосредственно благодаря молекулярно&ситовому механизму, либо вследствие межмолекулярных взаимодействий со стационарной фазой, на& несенной на эту поверхность. Количество стационарной фазы составляет обычно от 0,5 до 25% веса адсорбента. Это количество значительно больше количества, наносимого на капиллярную колонку. Поэтому на наполненные колонки можно наносить большие объемы пробы, так как в колонке находится соответственно большее количество стационарной фазы. Поэтому эти колонки, вследствие более сильного удерживания соответствующих компонентов, обладают хорошей разде& ляющей способностью по отношению к газам и парам. Равным образом, при ана& лизе побочных компонентов, преимуществом этих колонок может быть их высо& кая нагрузочная емкость.

С другой стороны наполненные колонки обладают рядом недостатков при исследовании компонентов с высокими точками кипения. Проницаемость на&

66 Глава 3. Газовая хроматография

полненных колонок очень низкая. Поэтому для установления оптимального по& тока газа придется мириться с большими перепадами давления, особенно при длинах колонок более 5 м. Тем не менее число теоретических тарелок у этих коло& нок может быть довольно высоким, особенно при использовании сорбентов с малым размером частиц.

Ввод пробы для заполненных колонок относительно прост, так как из&за вы& сокой нагрузочной емкости они могут делить с хорошей эффективностью боль& шие количества пробы. При этом нет необходимости в применении сплит&ин& жекторов.

Высота теоретической тарелки растет вместе с ростом диаметра колонки. Это снижение эффективности разделения может быть компенсировано путем увели& чения длины колонки. Для длинных колонок необходимо использовать высокое давление на входе в колонку. Сильный перепад давления на колонке приводит к тому, что вследствие сжимаемости газа&носителя только в небольшой части ко& лонки соблюдается оптимальная скорость потока, из&за чего разделяющая спо& собность колонки снова ухудшается.

Как правило, лишь небольшое число веществ соответствует требованиям раз& деления на наполненной колонке. В то же время она проще в применении при количественных определениях, а также, благодаря малому мертвому времени, она обеспечивает более быстрый результат, так что значение набивных колонок в пос& леднее время снова возросло. Чаще всего, из&за простоты обращения с ними, ис& пользуются колонки из нержавеющей стали. Если проба сильно полярна, то в некоторых случаях не избежать применения стеклянных колонок несмотря на то, что они после изготовления не могут изгибаться и их установка в хроматограф требует определенного навыка. Колонка, чтобы она легко устанавливалась в тер& мостате ГХ, закручена в спираль уже перед заполнением сорбентом, хотя это и затрудняет процедуру наполнения.

Так как хроматография начиналась с наполненных колонок, существует бога& тый опыт их применения и большое число продуктов для работы с ними. В каче& стве твердых адсорбентов для газового анализа используют, например, активиро& ванный уголь и окись алюминия. С давних пор на рынке появились также моле& кулярные сита, которые позволяют проводить очень специфические разделения. Графитизированный углерод имеет поры определенных размеров. Часто исполь& зовались и природные сорбенты, такие как диатомовая земля (кизельгур). Его свойства, однако, не обеспечивают эффективного разделения.

Высокой эффективности удается достичь при использовании сорбентов с боль& шой поверхностью и однородной структурой пор. Размывание пиков, вследствие неоднородности потока, меньше для частиц однородной формы и размера. Сор& бенты должны обладать механической прочностью и устойчивостью к разруше& нию и быть инертными по отношению к пробе.

В соответствии с этими требованиями был разработан ряд носителей. Хоро& шие носители не должны слишком сильно сорбировать компоненты пробы на поверхности частиц. Полярность стационарной фазы в этом случае будет опреде& ляется только полярностью стационарной жидкой фазы. Для каждого анализа подыскивается определенный носитель и покрывается жидкой фазой, которая в

значительной мере подавляет адсорбцию на поверхности носителя, и разделение происходит только на основании разделяющих свойств жидкой фазы. В настоя& щее время есть синтетические материалы, которые удовлетворяют всем приве& денным выше требованиям. Их однородные по размерам частицы имеют сфери& ческую форму. Механическая прочность позволяет им противостоять истиранию, а инертная однородная пористая структура обеспечивает равномерное нанесение разделяющей фазы.

3.3.2. Капиллярные колонки

Этот тип колонок очень популярен благодаря почти универсальной применимо& сти и выдающимся разделяющим способностям. Желание достичь большей эф& фективности разделения не может быть реализовано путем увеличения длины наполненных колонок. Этому препятствует возрастание сопротивления потоку подвижной фазы. М. Дж. Голей представил в 1957 году свои капиллярные колон& ки и запатентовал их [3.3]. Развитие капиллярной хроматографии привело к за& мещению металлических капилляров капиллярами из кварцевого стекла. Длина капилляров составляет от 10 до 200 м и диаметр внутреннего сечения – от 0,1 до 0,5 мм. Они не наполнены, не содержат сорбент во всем внутреннем простран& стве капилляра, а стационарная фаза нанесена тонким слоем (пленкой) на внут& ренние стенки капилляров. Благодаря тому, что колонка полая, она, даже при длине более 100 м, требует лишь небольшой перепад давлений для свой работы. Благо& даря такой высокой проницаемости при длине даже свыше 100 м перепад давле& ний в 1–2 атм достаточен для достижения оптимального потока газа&носителя. Существенное преимущество открытых капиллярных колонок состоит в значи& тельном уменьшении высоты теоретической тарелки согласно уравнению Ван& Деемтера, поскольку:

Вследствие отсутствия сорбента вихревая диффузия стремится к нулю.

В случае PLOT капиллярных колонок (от англ. полый капилляр с пористыми стенками) речь идет о капиллярах, внутренняя поверхность которых в качестве разделяющей фазы вместо жидкости покрыта слоем твердого пористого адсор& бента. Таким образом, речь идет о газоадсорбционной хроматографии. Разделе& ние происходит благодаря адсорбции и молекулярной эксклюзии [3.4]. Стацио& нарная фаза имеет толщину пленки от 0,05 до 10 мкм, и ее величина сильно зави& сит от диаметра внутреннего сечения капилляра. При малой толщине пленок силь& но понижается предельно допустимая нагрузка колонок этого типа, хотя, тем не менее, компоненты с высокими температурами кипения обладают короткими временами удерживания. В любом случае, остается невыгодной малая допусти& мая нагрузка этих колонок, которая делает необходимым применение специаль& ных систем ввода пробы. При подаче на капилляр количества пробы большего, чем позволяет емкость, происходит перегрузка колонки; что приводит к дефор& мации пиков.

Для получения гомогенных пленок, прочно связанных с поверхностью капил& ляра, перед нанесением жидкой стационарной фазы проводят обработку поверх&

68 Глава 3. Газовая хроматография

ности, например, травление или нанесение вспомогательного полимерного слоя. Изготовление капилляров – трудоемкий и длительный процесс, поэтому их полу& чают в промышленных масштабах и приобретают уже в готовом виде. Ряд стацио& нарных фаз доступен в виде так называемых пришитых фаз. Это значит, что фаза пришита химической связью к поверхности кварцевого стекла. Преимуществом этой колонки является высокая термическая устойчивость, также как возможность про& мывать колонку при сильном загрязнении органическими растворителями.

Когда аналитический метод старится и теряет былой блеск, начинается, как правило, его широкое коммерческое использование. В конкретном случае капил& лярной газовой хроматографии прошло почти двадцать лет до того момента, ког& да коммерческие капиллярные колонки подходящего качества также стали дос& тупны. Замена производимых в лабораторном масштабе капиллярных колонок на коммерческие произошла в конце семидесятых годов [3.5].

Капиллярная газовая хроматография перестала быть одним из специальных приемов и превратилась в ведущий хроматографический метод, научное понима& ние которого основывается на все более прочном фундаменте. Все же хрупкость колонок и почти полная невозможность встроить их в ГХ приборы старых моде& лей помешали их быстрому внедрению в аналитические лаборатории. Путь к их массовому применению был открыт, только когда были построены приборы спе& циально для работы со стеклянными (кварцевыми) колонками.

Исследования химии стекла очень упростили дезактивацию поверхности стек& ла и нанесение разделяющей фазы. Так что вряд ли сегодня есть какая&то фаза, которую нельзя нанести в виде гомогенной пленки. Недостатком так называемых WCOT колонок (открытые капиллярные колонки со слоем стационарной фазы на внутренних стенках, от англ.: wall&coated open tubular column) является малое количество стационарной фазы на внутренних стенках капилляра. Этот недоста& ток можно устранить, используя SCOT колонки (открытые капиллярные колон& ки с твердым носителем на стенках, от англ.: support&coated open tubular column) (рис. 3.4). В этих колонках на внутренней части капилляра нанесены дополни& тельные слои носителя с подходящим мелким размером зерна, которые насыща&

Рис. 3.4. Сравнение капиллярных колонок с тонкой пленкой (WCOT) и тонким сло& ем (SCOT) стационарной фазы

ются стационарной фазой. Эти колонки легко получить, и они обладают хорошей воспроизводимостью разделяющих свойств, но WCOT колонки имеют более ши& рокую область применения [3.6].

Все стеклянные капиллярные колонки, используемые в семидесятых годах, обладали тем недостатком, что содержали катионы. При более высокой темпера& туре они реагировали как основания и вызывали гидролиз сорбатов. Наиболее важным нововведением последнего времени в этой области стало, несомненно, внедрение в качестве материала колонки наряду с обычными щелочными и бор& силикатными стеклами «плавленного кварца», ПК («fused silica», FS). Плавленый оксид кремния SiO2 является инертным материалом, наружная поверхность квар& цевого капилляра покрыта слоем полиимида. Полиимдное покрытие предотвра& щает разрушение хрупкого материала колонки. Тонкостенные ПК&капилляры обладают большой механической гибкостью и могут быть поэтому легко встрое& ны в приборы с неподходящий геометрией. Из&за полиимидного покрытия они устойчивы до температур ~ 350 °C.

Процесс хроматографического разделения должен происходить исключитель& но при взаимодействии со стационарной фазой, а не с материалом колонки, ко& торый является лишь носителем стационарной фазы. Поэтому внутренние стен& ки колонки должны быть дезактивированы. Высокая степень чистоты используе& мого оксида кремния позволяет получать каталически неактивные поверхности. Дезактивация поверхности колонки необходима потому, что жидкие стационар& ные фазы при повышенных температурах колонки, особенно в присутствии ще& лочей, могут разрушаться, а на поверхности колонки может иметь место необра& тимая адсорбция сильнополярных веществ. Поверхность плавленого кварца или уже является малоадсорбционной даже и для полярных соединений, или может быть легко дезактивирована с помощью специальной обработки.

3.3.2.1. Фазовое отношение

Сегодня доступны капиллярные колонки с широким выбором внутреннего диа& метра Id, длины l, типа стационарной фазы и толщины пленок df. В качестве вспо& могательного средства для характеристики и выбора оптимальных размеров разде& лительных колонок можно использовать фазовое соотношение β. Распределение фаз является безразмерной величиной, которая рассчитывается из величин внут& реннего диаметра капилляра и толщины пленки. Соответственно, β равно отноше& нию объема газа&носителя в колонке к объему стационарной фазы. На рис. 3.5 схематически показано строение капиллярной колонки.

Фазовое отношение β является полезной вспомогательной величиной при выборе разделительных колонок, так как колонки с равными β в одинаковых ус& ловиях анализа и с одинаковыми стационарными фазами обладают почти иден& тичными относительными временами удерживания. Это означает, что колонки с разной толщиной пленок и диаметрами внутреннего сечения при одинаковых значениях β взаимозаменяемы.

Величины β рассчитывается из следующего выражения:

β = 0,5 Id/2 df.