Бёккер_Хроматография [2009]

290 Глава 5. Тонкослойная хроматография

Рис. 5.14. Типичный универсальный градиент

от этапа к этапу. Временные интервалы выбирают таким образом, что длина хро& матографического пути возрастает на каждом этапе примерно на 3 мм.

Уже в методе ПМЭ, который использует одну и ту же подвижную фазу на всех этапах, у разделенных фракций была тенденция концентрироваться в виде тон& ких полос (зон). Это происходит потому, что восходящей фронт подвижной фазы сначала контактирует с «нижней» частью зоны разделения и вызывает ее движе& ние в направлении разделения – и это происходит каждый раз, когда фронт ра& створителя проходит зону разделения. Этот механизм показан на рис. 5.15. Эф& фект концентрирования усиливается еще больше в методе АМЭ, где подвижная фаза, которая первой проходила зону разделяемых вещества, является самой по& лярной и оказывает, таким образом, самое сильное элюирующее действие на все компоненты. Первые пять ступеней разделения осуществляются смесью метанол – дихлорметан 50 : 50, затем десять ступеней, в которых содержание метанола по& степенно сокращается до нуля и т.д.

Таким образом, техника АМЭ является фокусирующей. Сначала восходящая подвижная фаза контактирует с нижней частью зоны веществ и вызывает его миг&

Рис. 5.15. Эффект концентрирования при прохождении каждого фронта раство& рителя

5.7. Проявление хроматограммы 291

рацию в направлении разделения, вследствие чего фракция фокусируется в виде тонкой полоски.

Комбинация фокусирующих эффектов и градиентного разделения позволяет добиться наиболее узких хроматографических зон, ширина пиков которых не за& висит от пути миграции. Типичное значение полуширины составляет 1 мм, так что на отрезке длиной 80 мм могут полностью разделяться до 40 компонентов (раз& деление до базовой линии). Инструментальная ТСХ, объединенная с автомати& ческим многократным элюированием и градиентом полярности элюента, отли& чается чрезвычайно высокой аналитической разрешающей способностью.

Затраты на воспроизводимое многократное элюирование оправданы только при использовании соответствующего автоматического устройства. Все парамет& ры, которые влияют на хроматографическое разделение, системой управляются или поддерживаются постоянными автоматически. До сих пор этот метод являет& ся единственным, который обеспечивает воспроизводимое градиентное разделе& ние ТСХ [5.9]. С помощью универсального градиента с первого раза могут разде& ляться вещества с очень различной полярностью. Это делает данный метод осо& бенно интересным для экологического анализа, где нужно обрабатывать очень сложные смеси веществ [5.10]. Однако в зависимости от выбора градиента пол& ный анализ может занимать при этом до нескольких часов.

Принцип работы устройства для автоматического многократного разделения представлен на рис. 5.16. Центральный модуль состоит из собственно камеры для разделения (1) с входами и выходами для подвижной фазы и для газовой фазы. Градиент подвижной фазы формируется с помощью градиентного смесителя (4) из отдельных компонентов, которые находятся в отдельных емкостях (2). Смеси& тель связан с емкостями для растворителей через кран, снабженный для переклю&

ТСХ пластинка

Рис. 5.16. Модуль для проведения автоматического градиентного элюирования в ТСХ (метод АМЭ)

292 Глава 5. Тонкослойная хроматография

чения мотором (3). Кондиционирование газовой фазы осуществляется пропуска& нием азота через промывную бутыль (5), который затем поступает в газосборник кондиционированного газа (6). Оттуда газовая фаза направляется в камеру для разделения. Система управляется микропроцессором, который можно свободно программировать.

Элюент из смесителя направляется в камеру, в которой находится пластинка для ВЭТСХ. Геометрия устройства для подачи элюента такова, что процесс хро& матографии начинается мгновенно и равномерно по всей ширине пластинки. По окончании заданного времени разделения, которое определяет длину пробега, подвижная фаза удаляется из камеры: сначала через сливные емкости (8), в кото& рых собираются остатки растворителей; затем, когда вся жидкость из камеры уда& ляется, эвакуируется с помощью масляного насоса (7) и, таким образом, слой сор& бента высушивается.

Перед началом следующего этапа разделения слой предкондиционируется га& зовой фазой из газосборника (6). Во время высушивания в смесителе (4) идет при& готовление подвижной фазы для следующего этапа.

Полная программа состоит из 25 этапов, т.е. 25&разовое разделение с увеличени& ем пути пробега и промежуточными высушиваниями длится примерно 4 час. Умень& шение числа ступеней до 20 сокращает общее время разделения уже на 2,5 час. Так как вся программа, включая конечное высушивание хроматограммы, полно& стью автоматизирована и пластинка в атмосфере азота, то такое разделение мо& жет проводиться в отсутствии персонала лаборатории [5.11].

5.7.9. Планарная хроматография

Планарная хроматография является, собственно говоря, наиболее простым и са& мым старым из известных методов и уже очень давно применяется с большим успехом (рис. 5.17). С развитием тонкослойной хроматографии она была предана забвению, пока, наконец, ее не открыли заново в ВЭТСХ и одновременно не пред& ложили прибор, контролирующий проведение разделений этим методом.

Слой сорбента в планарной хроматографии расположен горизонтально. Ве& щества наносятся кольцеобразно вокруг центра тонкослойной пластинки, под& вижная фаза подается в центр этих колец. Компоненты мигрируют с подвижной

Рис. 5.17. Принцип планарной (круговой) хроматографии

5.7. Проявление хроматограммы 295

5.7.10. Антикруговое элюирование

Антикруговое элюирование представляет вариант разделения, обратный круго& вой хроматографии. Подвижная фаза подается здесь на периферию круга и миг& рирует к его центру (рис. 5.20). Стартовые точки пробы расположены кольцеоб& разно по внешнему краю пластинки. По сравнению с линейным элюированием этим методом особенно хорошо разделяются вещества с большей величиной Rf.

Подвижная фаза подается на слой сорбента по окружности с радиусом 45 мм, откуда она движется в центр пластинки (рис. 5.21). До этого наносят пробы вдоль внутренней стороны этого круга. Количественная оценка при этом становится проще и точнее, так как при радиальном сканировании измерительной щелью все фракции охватываются полностью. Наблюдаемая при круговой хроматогра& фии поперечная диффузия фракций с высокой концентрацией здесь полностью подавляется.

Пластинка для ВЭТСХ, закрепленная в кольцевом держателе, устанавливает& ся затем на очень небольшом расстоянии над камерой. Для насыщения камеры газовую фазу можно подавать через центр на слой сорбента. Опускание пластин& ки непосредственно на камеру вызывает мгновенное поступление подвижной фазы из уже ранее наполненного кольцевого канала на слой сорбента. Подвижная фаза подается на слой за счет капиллярных сил. Ближе к наружному краю слой сор& бента прерывается круговой выемкой.

Антикруговой метод – наиболее быстрый из всех возможных видов элюиро& вания для данной подвижной фазы. Вследствие сочетания геометрии пластинки

Рис. 5.20. Принцип антикругового элюирования

Рис. 5.21. Устройство камеры для антикруговой тонкослойной хроматографии

296 Глава 5. Тонкослойная хроматография

и закона течения скорость движения подвижной фазы, направленной к центру, остается постоянной. Антикруговое элюирование – это единственный метод, ко& торый дает возможность использовать область высоких Rf. Хотя от антикругово& го метода не стоит ждать лучших результатов разделений, чем от линейного или даже кругового, он действительно интересен для рутинных анализов, в том числе из&за отсутствия проблем при определении положения проб и обработке сигнала.

5.7.11.Методы с принудительным потоком

Вто время как при проведении АМЭ, которое может длиться в зависимости от выбора градиента до нескольких часов, подъем подвижной фазы в стационарной фазе вызывают капиллярные силы, время разделения заметно сокращается в ме& тодах с принудительным потоком благодаря тому, что дополнительно создается внешний поток подвижной фазы. Так при элюировании с помощью центрифуги, а также при планарной хроматографии с циркулярным вращением транспорта под& вижной фазы поддерживают направленные от центра радиальные движущие силы. С принудительным потоком даже при микропрепаративных разделениях природ& ных веществ удается достичь замечательных результатов.

При планарной жидкостной хроматографии высокого давления (ПЖХВД) речь также идет о круговой или антикруговой технике разделения. Эта жидкостная хроматография в тонком слое под высоким давлением позволяет одновременно хроматографически разделять до 24 проб за 2 мин, причем разделение происхо& дит, например, при давлении 80 бар. Потребление подвижной фазы в высшей сте& пени незначительно и составляет 1 мл для разделения от 1 до 24 проб.

ПЖХВД функционирует следующим образом: стандартная пластинка для ВЭТСХ (100 × 100 мм) из стекла образует со второй стеклянной пластинкой, вы&

равнивающей давление пористой промежуточной пластинкой, и двумя стальны& ми зажимами «хроматографический сэндвич», как показано на рис. 5.22. Пробу можно дозировать внешним и внутренним способом. При внешнем вводе пробы необходим нанодозатор и автомат для ввода проб. Внутреннее дозирование про& исходит с помощью шестиходового крана, как в ВЭЖХ. При этом пробу вместе с подвижной фазой подают в центр пластины.

Сталь

Силикон

Стекло

Слой

Стекло

Сталь

Подвод пробы и подвижной фазы

Рис. 5.22. Устройство камеры типа «сэндвич» для ПЖХВД

5.8. Обработка тонкослойной хроматограммы 297

Подача подвижной фазы происходит с заданным давлением и в заданном коли& честве. Шаговый двигатель приводит в движение соединенный с прецизионным резьбовым механизмом поршень герметичного шприца объемом от 1 до 1000 мкл. Поток может изменяться от 1 до 2000 мкл в минуту. «Хроматографический сэндвич» прочно стягивается с помощью пневматического кривошипно&коленного пресса.

5.8. Обработка тонкослойной хроматограммы

После элюирования тонкослойные пластинки достают из камеры и сразу сушат, чтобы предотвратить дальнейшую диффузию пятен веществ. При этом хроматог& рамма как будто «замерзает», и разделенные вещества идентифицируются на пла& стинке. Проще всего это удается для цветных соединений, которые непосредствен& но видны на пластинке. Для бесцветных веществ необходимы особые методы об& наружения. Чтобы визуализировать разделенные вещества на пластинке, в пер& вое время в ТСХ почти всегда применялись опрыскивающие реагенты. Они образуют с пятнами веществ на слое сорбента окрашенные комплексы.

Многие вещества становятся видны благодаря поглощению или флуоресцен& ции, если тонкослойную пластинку рассматривают под коротковолновой или длинноволновой ультрафиолетовой лампой. При современной непосредственной количественной оценке ТСХ вполне возможна работа в ультрафиолетовом диа& пазоне спектра. Таким образом, от окрашивания, т.е. химической дериватизации, можно, в общем, отказаться.

Для оценки ТСХ в распоряжении есть множество методов, которые приспо& соблены к различным задачам. По сравнению с колоночной хроматографией пре&

Рис. 5.23. Методы обработки результатов ТСХ