Бёккер_Хроматография [2009]

120 Глава 3. Газовая хроматография

ГХ&МС система включает газовый хроматограф, масс&спектрометр, базу дан& ных, программное обеспечение для обработки данных и библиотеку спектров. При все более высокой мощности этих систем анализов цена измерений также сокра& тилась. МСД и ионная ловушка достигли размеров ГХ, и хроматограф больше не похож на аппендикс у масс&спектрометра. Большая чувствительность обнаруже& ния и временные характеристики разрешают объединять МС устройства с капил& лярной ГХ.

ГХВР%МС комбинация (ГХ высокого разрешения) в сочетании с разными метода% ми ионизации и установления структуры посредством обработки данных является в настоящее время самым эффективным методом анализа в смысле границ обнаруже% ния, а также количественной и качественной оценок.

Параллельно с квадрупольным детектором разрабатывалась ионная ловушка.

Вэтом случае ионизация происходит непосредственно в селекторе масс, и здесь нет никакого отдельного источника ионизации, фокусирующей системы, обогре& ва, а также сопутствующей электроники, что делает этот детектор дешевле. Наря& ду с этим находят применение масс&спектрометры высокого разрешения с посто& янным магнитом и высокочувствительные времяпролетные МС. С помощью двой& ных фокусирующих магнитных систем высокого разрешения в сочетании с ка& пиллярной ГХ сегодня можно определять точные молекулярные веса летучих соединений и рассчитывать эмпирические формулы. Из&за развития более быст& рых магнитов со временем сканирования от 0,2 с на массовую декаду исходное преимущество быстрого сканирования масс в квадрупольных приборах больше не является решающим.

Другой способ получения ионов представляет собой тепловое возбуждение в плазме. Наивысшей чувствительности определения достигают с помощью индук& тивносвязанной плазмы (ИСП) как источника ионов для масс&спектрометрии.

Вфакеле плазмы с помощью индуктивного подвода электрической энергии воз& никает аргоновая плазма с температурой более 6000 °C. Степень ионизации по& чти всех элементов составляет при этих высоких температурах более 90%. С арго& ном как газом&носителем компоненты газа переносятся непосредственно в фа& кел плазмы. Возникающие здесь ионы через охлаждаемый интерфейс переносят& ся в присоединенный квадрупольный масс&спектрометр, где определяются в соответствии с их зарядом и массой [3.49].

3.8.1.1.Квадрупольный масс%спектрометр

Вквадрупольном масс&спектрометре, также назваемом масс&селективным детек& тором, разделения масс происходит иначе, чем в масс&спектрометре с постоян& ным магнитным полем.

Между 4 магнитными стержнями поддерживается высокочастотное перемен&

ное электрическое поле. Если ионы попадают в поле, они вступают с ним во вза& имодействие. Только ионы с определенным отношением масса/заряд перемеща&

ются по стабильной траектории и достигают детектора. Варьируя электрическое поле, добиваются детектирования различных отношений масса/заряд (рис. 3.29).

3.8. Комбинированные методы газовой хроматографии 121

Детектор

Квадрупольный фильтр масс

Источник

ионов

Рис. 3.29. Принцип квадрупольного масс&спектрометра

Между ГХ и МС существует принципиальная несовместимость, так как масс& спектрометр работает под вакуумом 10–6 бар, а газовый хроматограф – при 1 бар. Для преодоления этих трудностей был разработан ряд интерфейсов.

Квадрупольный масс&спектрометр состоит в основном из трех частей:

•источник ионов,

•масс&фильтр и

•детектор.

Для получения ионов в большинстве случаев используется ионизация элек& тронным ударом, при которой нейтральные атомы и молекулы ионизируются бомбардировкой электронами с энергией 70 эВ. Источником самих электронов служит нагретая проволока (чаще всего из вольфрама или иридия, покрытого торием). При ионизации для каждого вещества и определенной энергии иони& зации возникает типичный набор фрагментов («отпечаток пальцев»), который позже играет важную роль при идентификации компонентов анализируемой газовой смеси.

Образующиеся ионы ускоряются и попадают в систему из стержневых элект& родов, собственно фильтр масс, где они попадают под воздействие высокочастот& ного переменного напряжения и приложенного постоянного напряжения. Под действием высокочастотного напряжения ионы осуществляют колебательное дви& жение, амплитуда которого растет с уменьшением массы, так что слишком лег& кие ионы покидают область масс&фильтра и не попадают в детектор. Тяжелые ионы, которые вряд ли последуют за высокочастотным напряжением, под дей& ствием постоянного напряжения медленно перемещаются к отрицательно заря& женным квадрупольным электродам. Только ионы из узкой области масс, квази& окна, проходят фильтр масс и попадают в детектор. Принципиальное устройство квадрупольного масс&спектрометра представлено на рис. 3.30.

Детектор состоит из ловушки Фарадея (Faraday&Cup) и дополнительно (по желанию) подключаемого фотоэлектронного умножителя (ФЭУ). Независимо от формы умножителя он всегда должен быть установлен таким образом, чтобы ионы

122 Глава 3. Газовая хроматография

Рис. 3.30. Устройство квадрупольного масс&спектрометра

двигались по траектории, совершая поворот на 90° перед встречей с ФЭУ, так как только тогда можно предотвратить мешающий шум, причиной которого яв& ляются свет, электроны и нейтральные частицы. Ток ионов или величина вто& ричного электронного тока умножителя является тогда мерой парциального дав& ления данного типа молекул внутри источника ионов. Этот очень маленький ток (примерно до 10–14 A) усиливается в предусилителе в высокочастотном блоке, оцифровывается затем в управляющем устройстве и выводится в виде показаний прибора.

Перенос вещества из ГХ в источник ионов масс&спектрометра происходит либо непосредственно, либо через интерфейс. При интерфейсе открытого типа, кото& рый сегодня предпочтительно применяется для ГХ&МС, отсутствует какое&либо закрытое соединение между концом капилляра и находящимся под высоким ва& куумом источником ионов. Место соединения омывается гелием. Конец капил& лярной колонки, таким образом, всегда находится при нормальном давлении, так что вакуум не влияет на эффективность хроматографического разделения и раз& решения. Кроме того, при таком соединении существует возможность удалить растворитель до источника ионов и можно легко поменять хроматографическую колонку при включенном масс&спектрометре [3.50].

3.8.1.2. Работа с ГХ%МС

Первый шаг в ГХ&МС анализе – это обычно сканирование всей области масс. Идентификация веществ происходит с помощью библиотеки спектров, занесен& ной в компьютер, который одновременно и управляет детектором. Изучение ха& рактеристических пиков и ионов молекул играет важную роль при идентифика& ции соединений.

В качестве примера рис. 3.31 показывает полный масс&спектр метилового эфи& ра бензойной кислоты.

Вторым шагом является количественный анализ, причем регистрируют от& дельные ионы. В режиме наблюдения выбранных ионов (англ.: SIM = Selected

124 Глава 3. Газовая хроматография

Сигнал

Масс/заряд

Время удерживания

Рис. 3.33. Пример хроматограммы полного ионного тока

Так как в режиме регистрации отдельных ионов при данном отношении мас& са/заряд измерение может проводится дольше, то чувствительность измерения при этом значительно повышается.

Если суммируют все единичные сканы и за все время анализа, то получают хроматограмму полного ионного тока (ПИТ, TIC), как это показано на рис. 3.33. Совершенствование метода ГХ&МС и стремительное развитие компьютерной тех& ники привели к тому, что масс&спектрометрией теперь занимаются не только спе& циалисты.

Масс&спектрометрия стала, таким образом, стандартным методом детектиро& вания для газовой хроматографии. Компьютер управляет всей системой, записы& вает данные и сохраняет масс&спектры. Запоминание многих масс&спектров в се& кунду требует высокой производительности процессора и большого объема памя& ти. В рутинном анализе этот процесс полностью автоматизирован с помощью про& граммного обеспечения. При использовании автодозатора до 100 проб могут обра& батываться по заданной программе от ввода пробы вплоть до выдачи результата.

Масс&спектрометр – это универсальный детектор. Если нужно проводить ко& личественный анализ методом регистрации отдельных ионов, то сначала должны быть оптимизированы параметры хроматографического разделения. Затем нуж& но выбрать массу (молекулярный ион или фрагмент), характерную для исследуе& мого соединения. Сигнал должен быть достаточно интенсивным и не перекры& ваться с другими сигналами. Затем оптимизируются масс&спектрометрические параметры, каждая масса калибруется, и устанавливается время измерения для каждого иона, учитывая ширину пика и соотношения ионов.

Те же самые хроматографические требования должны выполняться при про& ведении качественных анализов. Имеющиеся в интернете базы данных МС спек& тров облегчают идентификацию. Масс&спектрометр нужно настроить так, чтобы напряжение, используемое ионной оптикой, обеспечивало максимальное поступ& ление выбранных ионов в детектор. Для упрощения этого процесса современные

3.8. Комбинированные методы газовой хроматографии 125

масс&селективные детекторы обладают автоматически регулируемой настройкой, то есть они автоматически оптимизируют параметры.

3.8.1.3. Химическая ионизация

Хотя спектр, получаемый при ионизации электронным ударом (ЭУ), является важным для библиотечного поиска спектром «отпечатков пальцев» даже в облас& ти следовых количеств, он нередко оказывается бесполезным при идентифика& ции продуктов превращений, метаболитов или новых веществ, которые еще не зарегистрированы в коммерческих каталогах спектров. Самая ценная и макси& мально специфическая информация о соединении – сведения о его молекуляр& ной массе – часто отсутствует в спектре ЭУ; таким образом, это – повод для со& мнения, не является ли данная интерпретация неправильной.

В то время как ионизация электронным ударом (ЭУ) ведет к полной фрагмен& тации структуры молекулы, более мягкая химическая ионизация (ХИ) позволяет получить сведения о молекуле в целом. Нежелательная фрагментация часто в зна& чительной степени подавляется при косвенной ионизации реакционным газом (например, метаном, изо&бутаном или аммиаком). Доминирующие при этом про& цессы – это присоединение протона или других катионов из реакционной газо& вой плазмы.

Первичная реакция: R + Н+ → R–H+. Вторичная реакция: R–H+ + М → M–H+ + R.

Для проведения химической ионизации реакционный газ подается в источ& ник ионов. Сегодня источники ионов большинства масс&спектрометров специ& ально построены таким образом, что допускают простое изменение режима ЭУ на режим ХИ.

В первичной реакции необходимые реакционные ионы R–H+ (например, из NH3: NH4+) получаются в ходе ионизации реакционного газа R. Только во вторич& ной реакции ионы кластера реакционного газа реагируют с молекулами вещества, элюируемого из колонки в анализатор, например, путем протонирования М с образованием M–H+. Тем самым получают ион молекулярная масса + 1, что свя& зано с присоединением протона. Как пример на рис. 3.34 показаны спектры ЭУ и ХИ малатиона, средства защиты растений, с молекулярной массой 330. В спектре ЭУ молекулярный пик полностью отсутствует из&за сильной фрагментации, в то время как в спектре ХИ присутствует масса 331 (330 + 1).

3.8.1.4. Метод изотопного разбавления в МС%ГХ

Техника разбавления изотопов представляет для многих веществ высокочувстви& тельный и высокоспецифичный метод определения, в котором потери, неизбеж& ные во время подготовки пробы, в целом компенсируются.

В этом методе определяемое вещество, содержащее стабильный изотоп, до& бавляют к пробе в качестве внутреннего стандарта. Вещества с различными изо& топами едва ли отличаются по своим химическим и физическим свойствам и хро& матографируются в идентичных условиях. Однако, поскольку они обладают раз&

126 Глава 3. Газовая хроматография

Рис. 3.34. ЭУ& и ХИ&спектры малатиона

ными молекулярными массами, они могут отдельно детектироваться с помощью масс&спектрометрии.

Так как вещество, меченное стабильным изотопом, добавляется к пробе в оп& ределенном количестве, то его потери будут такими же, как и вещества, присут& ствующего в пробе. Для количественного анализа тогда рассчитывают отноше& ние МС сигнала немеченого соединения к сигналу меченого. Возникшие при под& готовке пробы потери будут, таким образом, скомпенсированы [3.51]. Тем не ме& нее, качественная пробоподготовка является, естественно, предпосылкой для получения хорошего результата анализов.

3.8.1.5. Техника ГХ%МС/МС

МС/МС, давно известная как специальная техника масс&спектрометрии, осваи& вается в последнее время также для ГХ [3.52]. В МС/МС сначала получают обыч& ный масс&спектр, т.е. как обычно поток ГХ&элюата ионизируется с помощью ЭУ& или ХИ&ионизации. Этот масс&спектр непосредственно не регистрируют, а вы& бирают из этого масс&спектра массу, которую называют материнской массой, це& левым ионом или, в большинстве случаев, обозначают сегодня в англоязычной литературе как ион&предшественник (Precurserion). Этот ион&предшественник за& тем ионизируется еще раз на второй ступени ионизации. Получаемый при этом масс&спектр детектируют и обрабатывают, он представляет собой масс&спектр про& дуктов распада иона&предшественника, его также называют масс&спектром до& черних ионов [3.53].

МС/МС дает, таким образом, масс&спектры отдельных ионов. Можно получить и обработать масс&спектры продуктов распада каждого из ионов&предшественни& ков. Спектры отдельных ионов из «обычных» масс&спектров могут быть полезны&

3.8. Комбинированные методы газовой хроматографии 127

ми с различных точек зрения. При выяснении путей фрагментации и при опреде& лении структуры МС/МС дает бесценную и часто иначе не доступную информа& цию. Этот метод позволяет улучшить отношение сигнал&шум, особенно при анализе следовых количеств. С помощью уменьшения химического шума, путем вычитания фона сложных матриц, удается достичь более низких пределов детектирования.

В особенности при идентификации и количественном анализе проб, которые осложнены наличием большого фона, МС/МС дает возможность однозначно рас& познавать, идентифицировать и количественно определять находящиеся в них вещества [3.54]. Даже вещества, которые перекрываются компонентами матри& цы, можно количественно определить однозначно и чрезвычайно точно. Преиму& ществами ГХ&МС/МС, таким образом, являются:

•однозначная идентификация (независимо от матрицы) и

•однозначный количественный анализ (независимо от матрицы).

МС/МС анализ проводится в магнитных секторных масс&спектрометрах и квад& рупольных ионных ловушках. Так как анализы МС/МС могут выполняться с обыч& ной ионной ловушкой с внешней ионизацией, то на рынке предлагаются деше& вые настольные устройства для анализа ГХ&МС/МС. Квадрупольная техника об& ладает сравнимыми возможности, но имеет то преимущество, что позволяет сни& мать спектры в более широком диапазоне масс.

Для квадрупольной техники необходимо как минимум три квадруполя. В та& ком анализаторе с тройным квадруполем первый квадруполь твердо ориентиро& ван на массу иона&предшественника. Средний квадруполь устроен как камера соударений, где фрагментация иона&предшественника индуцируется столкнове& нием с реакционным газом; он не работает как масс&спектрометр. В третьем квад& руполе дочерние ионы регистрируются в виде обычного масс&спектра. Эти про& странственно разделенные процессы происходят за миллисекунды, так что всегда достигается достаточное хроматографическое разрешение.

Наряду с регистрацией дочернего спектра конструкция тройного квадруполя предоставляет возможность записи также спектров ионов&предшественников и спектров нейтральных остатков. При сканировании ионов&предшественников на определенную массу настраивается только первый квадруполь, в то время как тре& тий квадруполь установлен на определенный дочерний фрагмент. При сканиро& вании спектра нейтральных остатков оба квадруполя настраиваются одновременно с определенной разницей масс. Таким образом, детектируются нейтральные фраг& менты с этой постоянной разницей масс для разных ионов&предшественников. Это дает отличную возможность проводить скрининги определенных классов ве& ществ. Так, например, отщепление COCl фрагмента указывает на диоксины [3.55].

Техника ГХ&МС/МС универсальна и предлагает значительно лучшие анали& тические возможности, чем одноступенчатая МС&ГХ. Она служит для расшиф& ровки структуры и дает большую надежность в следовом анализе. Детектирование отдельных дочерних ионов позволяет высокоселективное обнаружение и количе& ственное определение заранее выбранных соединений. При этом МС/МС техника может комбинироваться со всеми видами ионизации, такими как химическая ионизация.

128 Глава 3. Газовая хроматография

3.8.2. ГХ(ИК(Фурье

Долгое время инфракрасная спектроскопия была одним из излюбленных анали& тических методов. ИК спектроскопия очень популярна также и в комбинации с газовой хроматографией. Инфракрасная спектроскопия с Фурье преобразовани& ем (ИК&Фурье) является усовершенствованием ИК спектроскопии и дает реша& ющие преимущества: получение необходимой скорости и чувствительности для доказательства элюированных соединений [3.56]. Только при внедрении метода преобразования Фурье удалось соединить капиллярную ГХ высокого рарешения с инфракрасной спектроскопией.

Принцип инфракрасной спектроскопии основывается на том факте, что атомы в составе молекулы вибрируют с определенными характеристическими частотами, ко& торые характерны для межатомных связей в молекуле. Эти частоты лежат в инфра& красной области электромагнитного спектра. Если облучают пробу инфракрасным светом, то она поглощает характерные частоты. При этом возникающий набор час& тот с определенной интенсивностью известен как инфракрасный спектр поглоще& ния, характерен для каждого вещества и может служить для его идентификации. Ин& фракрасный спектр соединения дает сведения о классе соединения, а также о типе и положении функциональных групп или заместителей и может использоваться как отпечаток пальцев для однозначной идентификации многих известных соединений.

Задачей соединения газовой хроматографии и ИК спектроскопии является спек& троскопическая идентификация разделенных компонентов по инфракрасным спек& трам. Подобно комбинации ГХ&МС соединение хроматографа с ИК&Фурье спект& росктрометром создало метод, который нельзя охватить обычным понятием «ГХ детектор». Фурье ИК&спектроскопия разрабатывалась не для того, чтобы следить за разделением веществ, а как ценный качественный аналитический метод, с соб& ственной приборной базой и характерной для него историей развития, полнос& тью независимой от ГХ. С точки зрения этих больших устройств, хроматограф является системой ввода пробы с возможностью ее очистки.

Основой ИК&Фурье спектрометра является интерферометр Михельсона. На рис. 3.35 показано, какой путь проходит излучение ИК источника в интерферо& метре. Все излучение попадает на полупрозрачное зеркало. От него часть излуче& ния отражается на подвижное зеркало, а другая половина проходит сквозь него на неподвижное зеркало. Отраженный свет обоих зеркал затем снова встречается на дифракционной решетке. Лучи, которые приходят от обоих зеркал, обнаружи& вают различие фаз, если расстояние от подвижного зеркала до решетки отличает& ся от расстояния между неподвижным зеркалом и решеткой. В зависимости от расстояния, на котором находится подвижное зеркало, комбинируемые излуче& ния находятся либо в фазе, либо нет. Из&за этого возникает интерференция. Пос& ле того как свет покинул интерферометр, он направляется в измерительную ячей& ку, где поглощается соединениями, которые выходят из хроматографической ко& лонки хроматографа.

Для этой гибридной техники несомненно необходим ИК&Фурье спектрометр с высокой интенсивностью излучения и высокой стабильностью фона. В зависи& мости от производителя при записи спектров применяются два разных метода.