22.4. Генная терапия соматических клеток и половых клеток
Генная терапия предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мишени. Она проводится либо с целью коррекции наследственной патологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо для придания этим клеткам новых функций, способствующих устранению патологических процессов. В первом случае в организм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного гена. В другом случае вводят гены, обладающие условным цитотоксическим эффектом или способствующие формированию выраженного иммунного ответа. Данный метод применяют при лечении опухолей или инфекций. Мишенями для таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специфическим образом проникающие в эти ткани, либо предварительно трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом, объектом генетической трансфекции могут служить самые разные соматические клетки, как несущие дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие терапевтические свойства после трансфекции, в зависимости от характера заболевания и предполагаемого генотерапевтического подхода.
Проблема эффективной доставки генов в ткани организма с целью получения правильной дозы необходимого белкового продукта, обладающего терапевтическим эффектом, продолжает оставаться одной из центральной проблем генной терапии. В настоящее время существуют самые разные методы – физические, химические, биологические.
Выделяют два основных варианта переноса генов в соматические клетки: ex vivo и in vivo. Клеточная генная терапия, или терапия ex vivo, предполагает трансформацию клеток вне организма, с последующей реимплантацией их пациенту. Преимущества метода состоят в высокой эффективности трансформации, а также возможность наработки значительного числа клеток на культуральной среде. Данный метод использовался при проведении успешных клинических испытаний по генотерапии SCID X-SCID и других наследственных заболеваний иммунной системы.
Генная терапия in vivo заключается во введении гена непосредственно в организм пациента с последующим транспортом в клетки-мишени. Этот метод лечения был апробирован для лечения муковисцидоза. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких как муковисцидоз, энфизема, рак легких, при которых объектами генетической модификации являются специфические типы легочных клеток.
В настоящее время существует три основных направления доставки генетических конструкций:
- использование различного рода вирусных векторов (вирусные способы доставки);
- использование электропорации, баллистической трансфекции (физические способы доставки);
- использование невирусных носителей (невирусные способы доставки).
Главным условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, т.е. трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительной персистенции его в этих клетках и создание условий для полноценной работы, т.е. экспрессии. Преимущества и недостатки основных систем доставки генных конструкций указаны в таблице 1.
Таблица 22.1. Преимущества и недостатки систем доставки генных конструкций
Средство доставки |
Преимущества |
Недостатки |
"Голая" ДНК |
Производство, хранение и контроль качества очень просты и дешевы. Низкая иммуногенность |
Очень малая длительность экспрессии in vivo в большинстве тканей. Низкая эффективность трансфекции ex vivo и in vivo. Направленный перенос затруднен. |
Аденовирусы |
Высокая эффективность трансфекции in vivo и ex vivo. Трансфецирует пролиферирующие и непролиферирующие клетки. Накоплен значительный опыт в клиническом применении. Возможен направленный перенос. |
Повторное введение вызывает сильный иммунный ответ. Размер вставки – 7,5 т.п.н. Производство, хранение и контроль сравнительно сложны. |
Ретровирусы |
Обеспечивает длительную экспрессию in vivo. Высокая эффективность трансфекции ex vivo. Накоплен опыт в клиническом применении ex vivo. Сравнительно низкая иммуногенность. |
Низкая эффективность трансфекции in vivo. Размер вставки – 8 т.п.н. Трансфецирует только пролиферирующие клетки. Риск инсерционного мутагенеза. Производство, хранение и контроль очень сложны. |
Лентивирусы |
Трансфецирует пролиферирующие и непролиферирующие клетки. Трансфецирует гематопоэтические стволовые клетки. |
Размер вставки – 8 т.п.н. Производство, хранение и контроль качество крайне затруднены. Нет опыта клинических испытаний. |
Адено-ассоциированные вирусы |
Эффективно трансфецирует различные типы клеток in vivo. Обеспечивает длительную экспрессию in vivo. Сравнительно низкая иммуногенность. |
Размер вставки – 4,5 т.п.н. Риск инсерционного мутагенеза. Производство, хранение и контроль качества очень сложны. Небольшой опыт клинический испытаний. Повторное введение вызывает иммунный ответ и нейтрализацию вектора. |
Электропорация, баллистическая трансфекция |
Производство, хранение и контроль качества сравнительно просты. Низкая иммуногенность. |
Малая длительность экспрессии in vivo. Небольшой опыт клинических испытаний. Локальный эффект трансфекции. |
Катионные липиды |
Производство, хранение и контроль качества сравнительно просты. Высокая эффективность трансфекции ex vivo. Низкая иммуногенность. |
Низкая эффективность трансфекции in vivo. Малая длительность экспрессии in vivo. Небольшой опыт клинических испытаний. Направленный перенос затруднен. |
Катионные полимеры, пептиды |
Производство, хранение и контроль качества сравнительно просты. Высокая эффективность трансфекции ex vivo. Низкая иммуногенность. Возможен направленные перенос. |
Низкая эффективность трансфекции in vivo. Малая длительность экспрессии in vivo. Нет опыта клинических испытаний. |
Трансфекция с использованием некомпактизованной ДНК.
Прямой перенос "голой" (некомпактизованной) плазмидной ДНК конструкции в клетки животных in vivo явился одним из первых подходов в генной терапии.
В 1992 году Вольфом с соавторами была впервые осуществлена успешная доставка плазмидной конструкции с маркерным геном бета-галактозидазы в мышцы. Было показано, что инъецированная в мышцы незащищенная ДНК способна сохраняться и экспрессироваться в клетке до нескольких месяцев. В дальнейшем было обнаружено, что мышцы являются фактически единственной тканью, где незащищенная ДНК способна сохраняться так долго. Механизмы проникновения "голой" ДНК в клетку изучены недостаточно, однако существуют предположения что важную роль в этом процессе играет рецептор-опосредованный эндоцитоз.
Недостатками этого вида трансфекции являются низкая эффективность проникновения в клетки in vivo, краткосрочность экспрессии введенных конструкций в большинстве органов и тканей, за исключением мышц и кожи, а также отсутствие специфичности доставки. Преимуществом "голой" ДНК является дешевизна ее выделения и очистки, возможность наработки большого количества образцов. Плазмидная ДНК способна вызывать иммунный ответ, благодаря наличию последовательностей CpG, которые неметилированы у бактерий. Это является преимуществом в случае генной вакцинации, но недостатком при генотерапии хронических заболеваний. Метод генной вакцинации позволяет вызывать иммунный ответ с помощью введения плазмиды, кодирующей антиген. Одним из примеров является внутримышечное введение плазмиды, содержащей один из генов Plasmodium falciparum (возбудитель малярии), которое привело к появлению иммунного ответа на эпитопы данного паразита.
Одним из путей увеличения эффективности трансфекции может быть использование метода гидродинамического шока, принцип которого заключается во внутривенном либо внутриартериальном введении плазмидного вектора в растворе большого объема (до 10 % от массы животного в течение короткого промежутка времени). При введении генных конструкций данным методом в хвостовую вену мышей происходит трансфекция до 20 % клеток печени. При проведении аналогичных исследований на макаках удалось добиться трансфекции 40 % мышечных волокон. Основным недостатком данного подхода является сравнительно высокая смертность лабораторных животных (более 1 %).
Вирусные векторы.
Большинство проведенных исследований в области разработки средств доставки генных конструкций касалось вирусных векторов.
Эволюционно сложившаяся система обеспечения эффективного проникновения в клетки-мишени, а в случае ретровирусов – и система интеграции в клеточный геном, позволяет рассматривать вирусы как естественные векторы чужеродной ДНК для клеток млекопитающих. Вместе с тем нельзя недооценивать и вполне реальную опасность патологических процессов, связанных с использованием вирусных частиц. В качестве векторов применяют следующие ркомбинантные вирусы: ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирус герпеса, вирус СПИДа (HIV), вирус ветряной оспы и др.
Достоинства вирусных векторов:
Недостатки вирусных векторов:
|
|
Аденовирусы
|
Рис. 22.10. Аденовирусные векторы.
Аденовирусы являются наиболее эффективной системой доставки чужеродных генов. Они способны с высокой чувствительностью трансфицировать как делящиеся, так и покоящиеся клетки. Аденовирусные векторы (рис. 22.10.) не способны к интеграции в геном хозяина и лишены возможности к репликации. Одним из недостатков аденовирусов первого поколения являлась достаточно короткая длительность экспрессии трансгена. Первоначально размер вставки был ограничен 7,5 т.п.н. И существовала проблема высокой вероятности контаминации аденовирусных препаратов вирусами, способными к репликации, которые возникают благодаря рекомбинации между вектором и геномом клеток-продуцентов. В настоящее время разработаны новые комбинации аденовирусных векторов и продуцирующих клеток, которые позволяют избежать возникновения подобных вирусов. Также удалось увеличить пакующую способность данного вектора до 28-30 т.п.н. и получить возможность обеспечения специфичности аденовирусной трансдукции благодаря модификации поверхностных белков капсида для связывания различных клеточных рецепторов. Одним из главных недостатков аденовирусных векторов является индукция сильного иммунного ответа. Многие успешные клинические испытания по генной терапии основаны на применении в качестве средств доставки аденовирусов, тем не менее, именно при использовании аденовирусного вектора в испытаниях лечения дефицита орнитинтранскарбоксилазы впервые погиб пациент-доброволец.
Рис. 22.11. Ретровирусные векторы.
Впервые ретровирусные векторы (рис.22.11) были успешно применены в ходе первого в истории клинического переноса генов человеку в 1990 году, для генной терапии тяжелого комбинированного наследственного иммунодефицита (SCID). Большинство существующих ретровирусных векторов созданы на основе вируса лейкемии Молони мышей (MoMLV). В отличие от аденовирусов, данный тип векторов способен к интеграции в геном клетки-хозяина, что приводит к значительному увеличению длительности экспрессии введенного гена. Однако, ретровирусный вектор лишен сигналов ядерной транслокации и проникает в ядра только митотически-активных клеток. Соответственно, в виду того, что большинство клеток организма обладают низкой митотической активностью, эффективность трансдукции in vivo с использованием ретровирусов оказывается недостаточно высокой. Активация системы комплемента белками ретровируса также является причиной низкой эффективности трансдукции in vivo. Кроме того, использование ряда "терапевтических" генов для клонирования в ретровирусных векторах ограничивается размером вставки в 8 т.п.н. В последнее время исследуется возможность модификации и устранения имеющихся недостатков ретровирусных векторов.
Лентивирусные векторы.
Лентивирусы также как и ретровирусы способны к интеграции в хромосомы клеток-мишеней. Отличием лентивирусов от ретровирусов является возможность трансдукции непролиферирующих клеток благодаря наличию механизма ядерной транслокации. Наиболее исследованным лентивирусным вектором человека является вирус иммунодефицита человека, который был адаптирован в качестве вектора доставки чужеродных генов, благодаря возможности псевдотипирования с вирусом везикулярного стоматита, т.е. использование компонентов капсида данного вируса при наработке лентивирусного вектора. Опасность возникновения ВИЧ частиц, способных к репликации, устраняется.
По сравнению с ретровирусами, лентивирусные векторы обеспечивают большую эффективность трансфекции in vivo различных тканей. Однако, сложность наработки данных векторов и потенциальная возможность возникновения способных к репликации вирусных частиц накладывают ограничения на использование лентивирусов в широкой практике.
Аденоассоциированные вирусные векторы.
Аденоассоциированные вирусные векторы относятся к непатогенным парвовирусам приматов. Преимущества заключаются в их способности инфицировать, как покоящиеся, так и пролиферирующие клетки. А также способность к интеграции в геном клетки-хозяина.
Аденоассоциированные вектора интегрируют в хромосомы значительно менее эффективно, чем ретровирусы, и для них характерно длительное существование в свободной форме. Показано, что данный вектор обеспечивает наибольшую продолжительность экспрессии введенного гена – два года в организме мышей и несколько месяцев у собак, приматов и людей.
Потенциальным ограничением использования аденоассоциированных векторов является их иммуногенность. Главным недостатком является низкая пакующая способность – 4,5 т.п.н.
Векторы на основе вируса простого герпеса.
Для того чтобы ретро- и аденовирусные векторы инфицировали специфические типы клеток, нужно модифицировать их с помощью генной инженерии, однако, ВПГ I типа уже обладает сродством к определенному типу клеток. Он инфицирует нейроны и персистирует в них. Существует множество заболеваний, поражающих центральную и периферическую нервную систему: опухоли, метаболические и иммунные нарушения, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Вследствие тропности ВПГ к нервным клеткам он является подходящим вектором для генной терапии таких заболеваний. Доклинические испытания на экспериментальных животных показали, что гены, доставленные с помощью ВПГ-векторов в клетки мозга и периферической нервной системы, экспрессируются и поддерживаются длительное время. Однако до начала I фазы клинических испытаний ВПГ-векторов необходимо провести дополнительные исследования.
Невирусные способы доставки.
К преимуществам невирусных систем относятся отсутствие ограничений на размер генной конструкции, значительно меньшая по сравнению с вирусами иммуногенность. Помимо этого невирусные, особенно синтетические носители являются легко модифицируемыми системами, что облегчает процесс внесенияизменений в структуру комплексов и таким образом упрощает процесс их совершенствования.
К невирусным способам доставки относят:
прямая инъекция
рецепторо-опосредованный эндоцитоз
генное ружье
липофекция
электропорация
полимерные носители
Методы физической доставки генетических конструкций.
Наиболее известными методами физической доставки ДНК в клетки организма являются метод баллистической трансфекции ("генное ружье"), безигольное введение (needle-free injection), электропорация, и метод микроиъекций плазмидной ДНК. Принцип метода баллистической трансфекции заключается в том, что золотые микрочастицы с осажденной на них ДНК направляются к клеткам под действием сжатого газа при выстреле из специального устройства ("генного ружья"). При этом микрочастицы, пробивая клеточную мембрану, доставляют экзогенную ДНК в цитоплазму.
Безигольное введение предполагает использование в качестве доставки способа доставки плазмидной ДНК, осажденной на золотых частицах, потока физиологического раствора под высоким давлением. Указанные методы широко применяются для трансфекции клеток кожи и мышц для проведения "генной вакцинации".
Метод электропорации in vivo основан на локальном изменении электрического потенциала клеточной мембраны и возникновении пор после кратковременного воздействия серии разрядов электрического тока. Благодаря чему повышается уровень проникновения плазмидной ДНК в клетку и, соответственно, уровень экспрессии трансгена. Данный метод успешно применяется для лечения опухолей и трансфекции мышечных клеток. Привлекает своей простотой, доступностью, возможностями точной дозировки энергии электрического импульса.
Принцип метода микроинъекций заключается во введении чужеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку и является одним из наиболее часто используемых методов получения трансгенных животных. Однако, применение микроинъекий для генетической трансфекции многоклеточного организма не представляется возможным.
Недостатками существующих физических методов трансфекции являются невысокая эффективность и локальность эффекта доставки ДНК.
Генная терапия соматических клеток и половых клеток Доставка генных конструкций с использованием липосом.Данный метод подразумевает заключение ДНК внутрь липидного пузырька, который должен слиться с мембраной трансфецируемой клетки и таким образом обеспечить доставку конструкции в клетку. В экспериментах, проведенных Cristiano с соавторами, липосомы обеспечивали высокий уровень экспрессии маркерного гена в эндотелии легких мышей после введения суспензии комплексов в хвостовуювену, а также в эпителиальных клетках дыхательных путей после интраназального введения. Позже было показано, что липосомный метод трансфекции может являться перспективным для генной терапии муковисцидоза и бронхиальной астмы. Несмотря на то, что липосомы не обеспечивали такую эффективность проникновения ДНК в клетку, какая достигалась при использовании вирусных носителей, они были гораздо менее токсичны и иммуногены. Эта проблема была решена в 90-х годах двадцатого века созданием катионных липидов состоящих из положительно заряженной гидрофильной группы, связанной с липофильным остатком жирной кислоты. Основным недостатком новой конструкции считается нестабильность процесса формирования комплексов и их гетерогенность. По данным WenChi и соавторов, только одна из 1000 липосом обеспечивает экспрессию трансгена, тогда как эффективность вирусных носителей оказывается на порядок выше. Двухстадийное образование комплексов, включающее первичную компактизацию ДНК катионными пептидами и последующее присоединение липидного компонента, позволяет увеличить стабильность катионных липосом.
Доставка генных конструкций с использованием катионных полимеров.
Наиболее изученным катионным полимером является полиэтиленимин (ПЭИ). Существует несколько препаратов ПЭИ отличающихся по массе и разветвленности молекулы. Наиболее часто используют: разветвленные – 25-кДа ПЭИ (Aldrich) и 800-кДа ПЭИ (Fluka), линейный 22 кДа ПЭИ ExGen 500 (Euromedex).
ПЭИ способен связывать большие молекулы ДНК с образованием гомогенных комплексов размером до 100 нм, обеспечивать более эффективную защиту ДНК от нуклеазной деградации, чем другие поликатионы, благодаря высокой плотности заряда на поверхности молекулы и более плотной упаковки ДНК. При нейтральной рН только треть аминогрупп молекулы протонирована, и таким образом ПЭИ обладает значительной буферной емкостью. При кислых значениях рН при попадании комплекса ПЭИ/ДНК в эндосому, происходит протонирование большей части аминогрупп молекулы ПЭИ. Эффект "протонной губки" приводит к разрушению эндосом из-за осмотического шока, выходу комплексов в цитоплазму. Таким образом, протонирование аминогрупп ПЭИ предотвращает деградацию ДНК, происходящую при слиянии эндосом с лизосомами. Эндоосмотические свойства ПЭИ обеспечивают высокий уровень трансфекции in vitro, сравнимый с использованием вирусных векторов. Но из-за высокой токсичности, причиной которой является высокая плотность положительных зарядов, ПЭИ не применяется широко in vivo/
Одним из примеров поликатионных пептидных носителей ДНК конструкций является полилизин. Он был одним из первых полимеров, использованных для невирусной доставки ДНК в организм. Преимуществом аминокислотных носителей является биодеградируемость, что особенно актуально для доставки ДНК in vivo. Модификация полилизина остатками жирных кислот значительно увеличивает эффективность трансфекции iv vitro по сравнению с катионными липосомами.
В последнее время активно исследуются сополимеры полилизина, наиболее перспективными из которых считаются сополимеры лизина и гистидина, а также полилизин, модифицированный остатками имидазола.