Глава 19. Нарушения иммунитета

19.1. Синдром приобретенного иммунодефицита - спид

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) отнесен к семейству ретровирусов (Retroviridae), подсемейству медленных вирусов ( Lentivirus).

В настоящее время известны 7 видов лентивирусов, из которых 6 являются патогенными для животных и лишь один (ВИЧ) вызывает заболевание человека. Вирус иммунодефицита человека (Human immunodeficiency virus - HIV) был выделен в 1983 г группой профессора Люка Монтанье (Montagnier L.) из лимфатического узла больного СПИДом в Парижском институте Пастера. В том же году в США группа профессора Роберта Галло (R. Gallo) выделила вирус из лимфоцитов периферической крови больных СПИДом. Оба вируса оказались идентичными и ВОЗ в 1987 г приняла единое название - "вирус иммунодефицита человека" (ВИЧ, английская аббревиатура - HIV).

В настоящее время описаны 2 серотипа вируса: ВИЧ-1 и ВИЧ-2, различающиеся по структурным и антигенным характеристикам. Наибольшее эпидемиологическое значение имеет ВИЧ-1, который доминирует в современной пандемии и имеет наибольшее распространение на территории Российской Федерации. По данным электронной микроскопии, вирионы ВИЧ имеют округлую форму диаметром 100-120 нм. Наружная мембрана вируса построена из белков клетки хозяина и пронизана собственными белками вируса, которые обозначены как оболочечные белки.

Вирусная частица представляет собой ядро (cor), окруженное оболочкой (рис. 19.1). Ядро содержит двойную вирусную РНК, обратную транскриптазу (ревертазу), интегразу, протеазу. Различают два основных белка оболочки - трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 41кд (gр41) и внешний гликопротеин - 120кд (gр120) (табл. 19.1).

Нуклеоид вируса имеет округлую форму, но принимает продолговатую после отпочковывания вирусной частицы от клетки. Оболочка нуклеотида содержит протеин с молекулярной массой 24кд (р24). Между наружной оболочкой вириона и нуклеоидом существует каркас, состоящий из матриксного белка 17кд (р17).

Рис. 19.1. Структура и репликация ВИЧ.

 

Таблица 19.1

Группы белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2

Группа белков	ВИЧ -1	ВИЧ -2
Белки оболочки вируса	gр160 кд, 120кд, 41кд	gp140 кд, 105кд, 36кд
Белки сердцевины	p55 кд, 24кд, 17кд	p56 кд, 26кд, 18кд
Ферменты вируса	p66 кд, 51кд, 31 кд	p68 кд

Примечание. Молекулярная масса белков выражена в килодальтонах- кд; gp- гликопротеины; р- протеины.

В геноме ВИЧ выделены гены: env, pol, gag, отвечающие соответственно за продукцию белков оболочки, ферментов, ядерных структур и некоторые другие гены: tat, rev, vif, vpr, vpu, nef. В зависимости от строения отдельного фрагмента гена env в последнее время стали выделять "субтипы", обозначаемые заглавными буквами латинского алфавита А-Н, О и т.д. (табл. 19.2).

В естественных условиях ВИЧ может сохраняться в высушенном биосубстрате в течение нескольких часов в жидкостях, содержащих большое количество вирусных частиц, таких как кровь и эякулят - в течение нескольких дней, а в замороженной сыворотке крови активность вируса сохраняется до нескольких лет.

Нагревание до температуры 56°С в течение 30 мин приводит к снижению инфекционного титра вируса в 100 раз, при 70°- 80°С вирус гибнет через 10 мин; через 1 мин инактивируется 70% этиловым спиртом, 0,5% раствором гипохлорита натрия, 1% глутаральдегидом, 6% перекисью водорода. ВИЧ относительно мало чувствителен к УФ-облучению, ионизирующей радиации.

Таблица19.2

Гены и белки ВИЧ-1

гены	белки	примечание
env	gp120	Самый наружный белок обеспечивает связывание с клетками-мишенями. Лиганды - молекула CD4; галактозилцерамиды; рецепторы для цитокинов
	gp41	Обеспечивает интернализацию вириона в клетку
gag	р24	Составляет оболочку ядра вируса (нуклеокапсида)
	р17	Составляет матриксное вещество вируса
	р9	Связан с геномной РНК
	р7	Связан с геномной РНК
pol	р66	Обратная транскриптаза (синтез ДНК на матрице РНК)
	р31	Интеграза (встраивает ДНК вируса в клеточный геном)
	р10	Протеаза (расщепляет большие белковые трансляты на дифинитивные белки вируса)
tat	p14	Активирует транскрипцию с вирусных генов, стабилизирует вирусную мРНК, усиливает трансляцию с вирусной мРНК)
rev	p19	Существенен для экспрессии белков оболочки (Env)
nef	p27	(?) Может усиливать и ингибировать репликацию ВИЧ
vif	p23	Необходим для выхода новорожденных вирусов из клетки-мишени (вероятно, участвует в фолдинге белков Env)
vpu	p16	Необязателен для жизненного цикла вируса; усиливает отпочковывание вируса из клетки-мишени
vpr	p15	?
vpx	p16	?

Гликопротеин gр120 обусловливает присоединение ВИЧ к рецепторам СD4 клеток человека. При попадании ВИЧ в клетку под действием обратной транскриптазы синтезируется ДНК ВИЧ, встраиваемая в ДНК клетки-хозяина, которая в дальнейшем начинает продуцировать вирусные частицы.

Основа естественного иммунитета - это действие неспецифических механизмов, в большинстве своем реагирующих на повреждение тканей воспалительными реакциями. Некоторые клетки (макрофаги - МФ) и гуморальные факторы (комплемент, лизоцим) направлены на уничтожение бактерий. Другие клетки могут секретировать интерферон, действие которого в основном направлено против вирусов.

Адаптивный иммунитет основан на свойствах Т- и В-лимфоцитов избирательно отвечать на чужеродные вещества (антигены) с образованием специфической памяти и продукцией антител.

Попадая в организм человека, ВИЧ поражает различные органы и ткани, но, в первую очередь, клетки, несущие маркер СD4+ . В таблице 19.3 приведены основные типы клеток, поражаемых ВИЧ. В цитоплазме пораженных клеток освобождается вирусная РНК, и с помощью фермента обратной транскриптазы на основе вирусной РНК синтезируется ДНК - копия, которая встраивается в ДНК клетки хозяина (провирус). При каждом новом делении клетки все ее потомство содержит ретровирусную ДНК. В пораженной клетке начинают создаваться структурные элементы ВИЧ, из которых при помощи другого фермента - протеазы, собираются новые полноценные вирусы, в свою очередь поражающие новые клетки-мишени. С течением времени большинство зараженных клеток погибает.

Таблица 19.3

Типы клеток, поражаемых ВИЧ

Тип клеток	Ткани и органы
Т-лимфоциты, макрофаги	Кровь
Клетки Лангерганса	Кожа
Фолликулярные дендритные клетки	Лимфоузлы
Альвеолярные макрофаги	Легкие
Эпителиальные клетки	Толстая кишка, почки
Клетки шейки матки	Шейка матки
Клетки олигодендроглии, астроциты	Мозг

Уменьшение клеток, несущих рецептор СD4+, приводит к ослаблению цитотоксической активности CD8+ Т-лимфоцитов, уничтожающих инфицированные вирусом клетки. В результате теряется контроль за проникающими в организм возбудителями бактериальных, вирусных, грибковых, протозойных и других инфекций (оппортунистических), а также за клетками злокачественных опухолей. Одновременно происходит нарушение функции В-лимфоцитов, поликлональная активация которых приводит, с одной стороны, к гипергаммаглобулинемии, а с другой - к ослаблению их способности продуцировать вируснейтрализующие антитела. Повышается количество циркулирующих иммунных комплексов, появляются антитела к лимфоцитам, что еще больше снижает число CD4+ Т-лимфоцитов. Возникают аутоиммунные процессы. В начальных стадиях болезни в организме вырабатываются вируснейтрализующие антитела, которые подавляют свободно циркулирующие вирусы, но не действуют на вирусы, находящиеся в клетках (провирусы). С течением времени (обычно после 5-6 лет) защитные возможности иммунной системы истощаются, происходит накопление свободных вирусов в крови (возрастает т.н. "вирусная нагрузка").

Оппортунистические инфекции, как правило, имеют эндогенное происхождение и возникают за счет активации собственной микрофлоры человека вследствие снижения напряженности иммунитета (например, эндогенная активация микобактерий туберкулеза из очагов Гона).

Цитопатическое действие ВИЧ приводит к поражению клеток крови, нервной, сердечно-сосудистой, костно-мышечной, эндокринной и других систем, что определяет развитие полиорганной недостаточности, характеризующейся разнообразием клинических проявлений и неуклонным прогрессированием ВИЧ-инфекции.

Генетически обусловленная устойчивость к ВИЧ инфекции

На сегодняшний день известно, что несмотря на многочисленные сексуальные контакты с высокой степенью риска экспозиции ВИЧ, некоторые люди остаются неинфицированными. Некоторое время причина данного феномена оставалась неясной. Учеными ряда лабораторий из различных стран интенсивно изучался данный аопрос.. В настоящее время эти успешно завершенные исследования позволили на молекулярном уровне расшифровать один из механизмов устойчивости к ВИЧ-инфицированию и прояснить некоторые аспекты патогенеза ВИЧ-инфекции.

Практически одновременно тремя группами ученых были опубликованы результаты независимых исследований о том, что устойчивость к инфицированию ВИЧ генетически обусловлена и может передаваться по наследству.

Как было ранее выявлено, у ВИЧ-1 существуют изоляты, отличающиеся по тропности к макрофагам и Т-лимфоцитам. Ряд изолятов вируса иммунодефицита человека, называемых М-тропными, поражают макрофаги, но не трансформированные Т-клеточные линии. Они относятся к необразующим синцития вирусам (NSI). Т-тропные изоляты ВИЧ-1 (SI-образующие синцитии вирусы) инфицируют Т-лимфоциты. При этом оба типа ВИЧ-1 изолятов эффективно инфицируют мононуклеарные клетки периферической крови. М-тропный NSI ВИЧ-1 передается главным образом при половых контактах и доминирует у первично инфицированных лиц. Т-тропный SI вирус обычно выявляется позднее в процессе развития клинических симптомов заболевания.

Достаточно давно известно, что необходимым условием для инфицирования клетки ВИЧ-1 является наличие на ее поверхности определенной белковой молекулы - СD4 рецептора. Этот рецептор, присутствующий в клетках в количестве до 10 000 копий, и опосредует ряд их функций в системе клеточного иммунитета. Однако ВИЧ использует СD4 рецептор для проникновения в клетку.

Репликация ВИЧ инициируется прикреплением вируса к клеточной поверхности путем высоко аффинного связывания его оболочечного гликопротеина (Env) с рецепторами CD4. Однако в проведенных позднее исследованиях было показано, что наличия СD4 недостаточно для инфицирования клетки ВИЧ. Для проникновения вируса через клеточную мембрану в цитоплазму и освобождения его ядра необходимо взаимодействие ВИЧ с дополнительными корецепторами. Такой корецептор, выявленный у CD+ Т-лимфоцитов, был назван Fusin. Ген, кодирующий Fusin, локализован на 2 хромосоме в области 2q21. На CD+ макрофагах обнаружен корецептор СKR-5. Таким образом, различия в свойствах Т-тропных и М-тропных вирусов обусловлены способностью Env-белков ВИЧ-1 взаимодействовать с разными корецепторами: первые используют Fusin, вторые - взаимодействуют с CKR-5.

Ген, кодирующий CKR-5, локализован на хромосоме 3 в области 3p21. Генетический кластер 3p21 включает так же гены, кодирующие рецепторы CKR-1 и CKR-2b. Показано, что CKR-5 является клеточным трансмембранным рецептором для b -хемокинов RANTES, MIP-1a, MIP-1b - регуляторов, посредников межклеточных взаимодействий. Существуют данные о действии этих веществ в качестве природных супрессоров репликации М-тропных ВИЧ-1.

В свете имеющихся данных возможны следующие механизмы устойчивости некоторых людей к инфицированию М-тропными ВИЧ-1:

1. Конкурентное ингибирование - блокирование корецептора CKR-5 избытком эндогенных хемокинов в результате их гиперпродукции. В литературе описаны устойчивые к инфицированию ВИЧ-1 лица с гиперпродукцией в-хемокинов, превышающей норму в 10 раз.

2. Генетически обусловленные изменения:

А) структуры самого корецептора CKR-5, блокирующие проникновение ВИЧ-1 в клетки;

Б) уровня транскрипционной активности гена CKR-5.

Уровень транскрипционной активности генов, кодирующих корецепторы, был определен у устойчивых к инфицированию ВИЧ-1 пациентов и контрольной группы доноров методом RT-PCR (обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция) с использованием эквивалентных количеств РНК, выделенной из охарактеризованных Т-клеточных клонов. Результаты этих исследований показали, что уровень транскрипции генов CKR-5, CKR-1 и Fusin не отличается от нормы во всех клеточных клонах.

От лиц, устойчивых к инфицированию ВИЧ-1, и нормальных доноров методом RT-PCR была выделена кДНК, кодирующая CKR-5, на основе которой были сконструированы экспрессирующие вектора, использованные для трансфекции специальной линии клеток человека. В экспериментах по инфицированию таких трансформированных клеток М-тропным ВИЧ-1 было показано, что от устойчивых к ВИЧ-1 лиц экспрессируется функционально неактивный CKR-5, не позволяющий проникать вирусу в клетку. В то же время другие корецепторы - Fusion и CKR-1 остаются у этих лиц функционально активными. Эти данные дали возможность исследователям предположить, что устойчивость к инфицированию ВИЧ обусловлена генетическими нарушениями гена CKR-5, приводящими к трансляции функционально неактивного корецептора CKR-5. Действительно при анализе первичной структуры гена, кодирующего CKR-5 у устойчивых к ВИЧ-1 лиц, была выявлена делеция в 32 пары нуклеотидов в позиции 794- 825. Таким образом, было показано, что устойчивость к инфицированию ВИЧ-1 обусловлена мутацией гена, кодирующего структуру трансмембранного корецептора CKR-5. Таким образом, делеция 32-х пар нуклеотидов в гене СКR-5 обусловлена не результатом “сплайсинга” мРНК после транскрипции, а присутствует именно в геномной ДНК, передается по наследству и не связана с признаком пола.

У каждого человека в клетке имеется две копии продуцирующего молекулу CKR-5 гена (на отцовской и материнской хромосоме). Таким образом, наличие или отсутствие данной мутации у человека можно представить следующим образом:

+/+ - нет делеции ни в одном из генов: экспрессируется нормальный уровень активного корецептора;

+/d - делеция в одном из генов: уровень экспрессии активного корецептора вдвое ниже;

d/d - делеция в каждом гене: экспрессируется только дефектный корецептор, не позволяющий ВИЧ-1 проникать в клетку.

Наличие двух дефектных копий каких-либо генов может обуславливать наследственные заболевания. Однако в данном случае не обнаружено каких либо фенотипических изменений как в случае d/d, так и в случае +/d.

Данные, полученные при исследованиях, проведенных в США и западной Европе на группе риска (больные гемофилией, внутривенные наркоманы, гомосексуалисты) на наличие делеции в гене CKR-5, представлены в таблицах 19. , 19:

Таблица 19.4

Результаты исследований, проведенные в США

Иммунный статус по ВИЧ	Кол-во	+/+	+/d	d/d
серопозитивные	1343	1148 (85 %)	195 (15 %)	0
серонегативные	612	508 (83 %)	87 (14 %)	17 (3 %)
всего	1955

Таблица 19.5

Результаты исследований, проведенные в западной Европе

Иммунный статус по ВИЧ	Кол-во	+/+	+/d	d/d
серопозитивные	723	645 (89,2 %)	78 (10,8 %)	0
серонегативные	704	582 (82,7 %)	114( (16,2 %)	8 (1,1 %)
всего	1427

В результате проведенных исследований сделаны следующие выводы:

1. Среди серопозитивных по ВИЧ лиц не обнаружено ни одного человека с мутацией d/d, что подтверждает защитный против ВИЧ-инфицирования характер мутации.

2. Достоверно установлено, что у лиц с генотипом +/d СПИД начинается в среднем позже и болезнь прогрессирует медленнее, чем у лиц с генотипом +/+. Однако это справедливо только для лиц, инфицированных при сексуальных контактах, но не для гемофиликов. Это связано, по-видимому, с разными путями трансмиссии и уровнем экспозиции вирусом, так как гемофилики получают большую дозу вируса при внутривенных инъекциях, чем передается при сексуальных контактах.

3. Лица с генотипом d/d из группы риска при множестве сексуальных контактов экспозировались, скорее всего, как М-тропным NSI-вирусом, так и Т-тропным SI-вирусом, однако остались неинфицированными, хотя имели функционально активные рецепторы Fusin, CKR-1, CKR-2b. Это дает возможность предположить центральную роль корецептора CKR-5 в трансмиссии и/или дальнейшем распространении как М-тропных, так и Т-тропных вирусов в организме in vivo.

Самый высокий уровень резистентности к ВИЧ, связанный с мутацией гена белка-корецептора CCR5, существует у представителей финно-угорской группы: финнов, эстонцев, венгров, мордвин. Наличие такой мутации в одном из двух парных генов здесь достигает 15-17%. Достаточно много подобных людей среди населения Северной Европы, на юге и на востоке их число существенно меньше. Так, среди афроамериканцев они составляют всего 1-2%. А среди представителей многих других рас их вообще нет. Таким образом, существует градиент распределения ВИЧ-устойчивых людей по планете (рис. 19.2).

Мутация гена корецептора CKR-5 по грубой оценке, проведенной на основании имеющихся данных исследований появилась 150000- 200000 лет назад. Относительно более высокая частота её встречаемости среди европеоидов в Западной Европе позволяет предположить об участии в отборе исторического селективного давления, осуществляемого, возможно, другими вирусами или паразитами, использующими для инфицирования рецептор CKR-5.

Рис. 19.2. Градиент распределения ВИЧ-устойчивых людей по планете (цветовой переход на карте соответствует изменению значений частоты (указан в шкале интервалов). Карта выявляет четкую клинальную изменчивость: падение частоты мутации от Северной Европы (выше 15%) к югу и востоку. Так, если в Европе в целом частота мутации превышает 5%, то в Африке южнее Сахары и Восточной Азии мутация практически отсутствует. (рис. д.б.н.Е.В. Балановской).

Для выявления делеции 32 пары оснований в гене CKR-5 были разработаны следующие методы:

1. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, фланкирующими область в позиции 760- 942 гена CKR-5, с последующей детекцией полученных амликонов гель-электрофорезом в агарозном геле. Дикий тип (+/+) дает в электрофорезе одну полосу 182 пары оснований; смешанный тип (+/d) дает две полосы - 182 и 150 пар оснований; мутантный тип (d/d) -- дну полосу 150 пар оснований.

2. Метод ПЦР с праймерами, фланкирующими полный ген CKR-5, с последующей рестрикцией ампликона рестриктазой Hinf I и детекцией рестриктов методом SSCP (конформационный полиморфизм одноцепочечных нуклеиновых кислот).

3. Метод ПЦР с праймерами, фланкирующими область CKR-5 гена в 732 пары оснований, с последующей рестрикцией ампликона рестриктазой EcoRI, гель-электрофорезом, гибридидизацией с 32-Р-меченным зондом и радиоавтографией.

Во всех случаях геномная ДНК выделяли либо из культуры клеток исследуемых лиц, либо из клеток крови.