7. Подсчет клеток микроорганизмов в счетных камерах Сущность метода

Метод прямого счета микробных клеток в счетных камерах – один из наиболее быстрых и достаточно точных. Данный метод успешно применяется для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях. Однако счетные камеры Горяева, Нажотта могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов – клеток водорослей, дрожжей грибов, микроскопируемых при увеличении микроскопа (окуляр 10–15, объектив 8–40).

Устройство и подготовка камеры Горяева

Счетная камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло с прямоугольным углублением в центре. Глубина камеры составляет 0,1+0,005 мм. На дне углубления нанесена сетка из 400 квадратов. Сторона сетки соответствует 3+0,005 мм, площадь одного малого квадрата соответствует 1/400 мм², большого – 1/25 мм².

Каплю с микроорганизмами помещают в центр камеры и накрывают специальным покровным стеклом, тщательно притирая его по краям камеры до появления ньютоновских колец. При этом толщина слоя жидкости в камере над сеткой соответствует 0,1 мм, а объем камеры 0,9 мм³ (около 1мм³). Каждый малый квадрат ограничивает объем жидкости в 1/4000 мм³ , или 1/4000000 мл (1 мл = 1000 мм³).

Подсчет клеток в камере начинают через 3...5 мин. после заполнения ее, когда клетки осели и расположились в одной плоскости. Подсчет клеток ведут обычно в 10 больших либо в 20 малых квадратах, перемещая их по диагонали. Количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10.

Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600, поэтому из исследуемой взвеси микроорганизмов берут 3 – 4 пробы для монтажа камеры.

Материалы и оборудование

• счетная камера Горяева;

• водоструйный насос;

• мембранные фильтры № 5,6;

• колба на 500мл с пробой природной воды;

• склянка на 20мл из-под пенициллина;

• пипетка глазная;

• микроскоп;

• кисточка колонковая;

• формалин 40%.

Проведение анализа

Пробу природной воды содержащей водоросли, объемом 500 мл, сгущают с помощью водоструйного насоса на мембранном фильтре. В конце фильтрования необходимо следить, чтобы над фильтром остался тонкий слой воды. Затем сгущеный осадок с фильтра осторожно переносят в склянку при помощи кисточки и доводят до объема 5мл дистиллированной водой. Консервируют препарат формалином или раствором Люголя.

После тщательного взбалтывания, каплю взвеси с водорослями из склянки наносят в центр счетной камеры пипеткой. Счетную камеру накрывают покровным стеклом, тщательно притирая его с краев до образования ньютоновских колец (цветных полос).

Подсчет клеток в камере начинают через три – пять минут после ее заполнения, когда клетки осели и расположились водной плоскости. Подсчет клеток ведут обычно в 10 больших либо в 20 малых квадратах, перемещая их по диагонали.

Для статистической достоверности в каждой пробе необходимо определить и просчитать все виды не менее трех раз с последующим вычислением среднего арифметического. Пересчет общей численности производится по формуле

(50)

где N – число клеток в 1 мл воды, n – число клеток в камере объемом 1мм³; v_{1 –} объем концентрата пробы (5 мл); v₂ – объем камеры в мл (0,001); w – объем профильтрованной воды (500 мл);

Отчет по работе должен содержать:

• расчет общей численности водорослей;

• расчет численности доминирующих видов;

• рисунки часто встречающихся видов.