4. Определение концентрации белка в моче методом разведения. Расчет результатов

Метод Брандберга–Робертса–Стольникова

Реактивы: 50% раствор азотной кислоты или реактив Ларионовой.  Приготовление реактива Ларионовой: готовят насыщенный раствор хлорида натрия (20 – 30 г соли растворяют в 100 мл воды при подогревании, дают отстояться до охлаждения). Надосадочную жидкость сливают, фильтруют. К 99 мл фильтрата добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты. Вместо азотной кислоты можно добавить 2 мл концентрированной соляной кислоты.

Ход определения: В пробирку наливают 1 – 2 мл азотной кислоты (или реактива Ларионовой), дают кислоте стечь со стенок пробирки (5 – 8 минут), иначе при наслаивании белковой мочи образуется муть вследствие смешения азотной кислоты на стенках пробирки с мочой, что мешает образованию отчетливого кольца. Поэтому следует предварительно приготовить серию пробирок с кислотой. Пипеткой осторожно по стенке пробирки наслаивают такое же количество профильтрованной прозрачной мочи, стараясь не взбалтывать жидкость в пробирке. Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2-й и 3-й минутой указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. Время наслаивания считают за четверть минуты.

Если кольцо появляется раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т. е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся раньше 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком – в 4 раза, при компактном – в 8 раз и т. д. Разведение мочи делают в мерной центрифужной пробирке, наливая мочу до метки 1 мл и доливают водой до той метки, во сколько раз делается разведение. Содержимое пробирки тщательно перемешивают пастеровской пипеткой с баллоном. Если при разведении мочи появляется муть, то смесь нужно вновь отфильтровать и только прозрачный фильтрат наслаивать на азотную кислоту. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на литр (г/л). Подбирают такое разведение мочи, чтобы при наслаивании ее на азотную кислоту кольцо появилось на 2 – 3-й минуте.

В случае, если с неразведенной или разведенной мочой кольцо образуется между 1-й и 4-й минутой, можно пользоваться поправкой Эрлиха-Альтгаузена, для того, чтобы не разводить мочу дополнительно (это экономит время). Авторы предложили определить время появления нитевидного кольца и внести в расчет поправку на время. В этом случае количество белка рассчитывают, умножая 0,033 г/л на степень разведения и на поправку.

Расчет белка: мочу развели в 4 и 2 раза, следовательно, в 8 раз. Количество белка равно 0,033*8*1¹/₄ = 0,33 г/л

Недостатки метода Брандберга-Робертса–Стольникова:

субъективность,

трудоемкость,

снижение точности определения концентрации белка по мере разведения мочи.

5. Определение концентрации белка в моче нефелометрическим методом с 3%сульфосалициловой кислотой, расчет результатов, аналитическая процедура

Основан на свойстве белка давать с сульфосалициловой кислотой помутнение, интенсивность которого пропорциональна концентрации белка.

В градуированную пробирку наливают 1,25 мл профильтрованной мочи и добавляют до объема 5 мл 3% раствор сульфосалициловой кислоты, тщательно размешивают. Через 5 мин измеряют экстинкцию на ФЭК-М (или любом другом фотометре) при длине волны 590-650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете с толщиной слоя 0,5 см. Для контроля используют 1,25 мл профильтрованной мочи (той же), к которой до объема 5 мл доливают изотонический раствор хлорида натрия.

Предварительно строят калибровочную кривую зависимости величины экстинкции от концентрации белка. Для приготовлений различных концентраций белка используют стандартный раствор альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки). Заполняют рабочую таблицу