спектроскопические методы анализа

возбужденного триплетного состояния в синглетное основное. Такие переходы не разрешены, и константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции – от миллисекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации.

Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции – это зависимость интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чисел (в см 1). Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены на рис. 3.44.

Рис. 3.44. Спектры поглощения и испускания флуоресценции натриевой соли терасульфоперилена (а) и флуоресцеина (б) в воде

Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя. Спектры некоторых соединений, таких как перилен и его производные, имеют четкую структуру, обусловленную отдельными колебательными уровнями

81

энергии основного и возбужденного состояний. Другие соединения, такие как флуоресцеин, имеют спектры без колебательной структуры.

Флуоресценция и другие релаксационные процессы возбужденных молекул

Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная А. Яблонским (рис. 3.45).

Рис. 3.45. Диаграмма Яблонского

Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S0, S1, и S2 соответственно. Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Переходы между различными электронными уровнями обозначают вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происходит примерно за 10 15 с, время, слишком короткое для заметного смещения ядер (принцип Франка – Кондона).

За поглощением света обычно следует несколько других процессов. Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого

82

высшего колебательного уровня состояний (S1 либо S2). 3а некоторыми редкими исключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая релаксация на самый нижний колебательный уровень состояния S1. Этот процесс называется внутренней конверсией. Внутренняя конверсия – безызлучательный переход между двумя электронными уровнями с одинаковой спиновой мультиплетностью, происходит за 10 12 с. Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10 8 с, внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до процесса испускания. Таким образом, спектр поглощения молекулы отражает колебательную структуру возбужденных электронных состояний, а спектр испускания – колебательную структуру основного электронного состояния. В большинстве случаев электронное возбуждение не сильно изменяет расположение колебательных уровней энергии. В результате этого колебательные структуры, проявляющиеся в спектрах поглощения и испускания, сходны.

Молекулы в состоянии S1 могут также подвергаться конверсии в первое триплетное состояние Т1. Испускание из Т1, называемое фосфоресценцией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из S1 в Т1 называется интеркомбинационной конверсией. Интеркомбинационная конверсия – безызлучательный переход между двумя изоэнергетическими колебательными уровнями, принадлежащими электронным состояниям с различной мультиплетностью. Переход из Т1 в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции.

Когда молекула возбуждена поглощением фотона, она может вернуться в основное состояние путем испускания флуоресценции, однако возможны и другие пути релаксации: внутренняя конверсия, интеркомбинационная конверсия, внутримолекулярный перенос протона или электрона, конформационное изменение, образование эксимеров и эксиплексов, перенос энергии и фотохимические трансформации. Взаимодействия в возбужденном состоянии с другими молекулами также могут конкурировать с релаксацией: электронный перенос, перенос

83

протонов, перенос энергии, образование эксимеров и эксимерных комплексов.

Данные направления релаксации могут конкурировать с испусканием флуоресценции, если они протекают в масштабно-временном соответствии со средним временем (временем жизни), в течение которого молекулы находятся в возбужденном состоянии. Это среднее время представляет собой экспериментальное временное окно для наблюдения динамического процесса. Характеристики флуоресценции (спектр, квантовый выход, время жизни), на которые влияет любой процесс в возбужденном состоянии, включая взаимодействия возбужденных молекул с их ближайшим окружением, могут дать информацию о такой микросреде. Необходимо отметить, что некоторые процессы в возбужденном состоянии (изменение конформации, электронный перенос, перенос протонов, перенос энергии, образование эксимеров или эксимерных комплексов) могут преобладать для флуоресцентных соединений, эмиссия которых способна накладываться на эмиссию начально-возбужденной молекулы. Такое излучение следует отличать от «первичной» флуоресценции, возникающей от возбужденной молекулы.

Закон Стокса: спектр флуоресценции лежит в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения, так как энергия испускаемого кванта ниже, чем энергия поглощенного кванта.

Потери энергии между возбуждением и испусканием неизменно наблюдаются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень состояния S1. К тому же обычно происходит переход на возбужденные колебательные уровни состояния S0, что приводит к дополнительной потере колебательной энергии.

Кроме того, стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях. В газовой фазе у атомов и молекул не всегда имеется стоксов сдвиг. Испускание без сдвига наблюдают тогда, когда концентрации газа достаточно малы для того, чтобы возбужденные молекулы не претерпевали столкновений с другими молекулами до процесса

84

испускания. Такие столкновения приводят к релаксации. В жидкой фазе процессы соударения происходят непрерывно.

Стоксов сдвиг – важный параметр, который может дать информацию о возбужденных состояниях. Например, когда дипольный момент флуоресцентной молекулы в возбужденном состоянии больше, чем в основном, стоксов сдвиг растет вместе с полярностью растворителя. На этом явлении основаны флуоресцентные датчики полярности раствора.

С практической точки зрения обнаружение флуоресцентных молекул тем проще, чем больше стоксов сдвиг.

Закон зеркальной симметрии (правило Левшина) – спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, поскольку структура колебательных подуровней одинакова в основном и возбужденном состоянии. Схематично правило представлено на рис. 3.46.

Рис. 3.46. Правило зеркальной симметрии Левшина

Несмотря на то, что правило зеркальной симметрии часто выполняется, из него существует множество исключений. Например, дифенил. В спектре испускания видна колебательная структура, которая отсутствует в спектре поглощения. Такое отклонение от правила

85

зеркальной симметрии обычно указывает на различное геометрическое расположение ядер в основном и возбужденном состояниях.

Кроме геометрических перегруппировок отклонение от правила зеркальной симметрии могут вызвать также реакции в возбужденных состояниях. Так, например, для фенола и тирозина наблюдается по две полосы испускания, причем длинноволновое испускание более заметно при высоких концентрациях акцепторов протона. Величина рКа фенольной гидроксильной группы уменьшается от 11 в основном состоянии до 4 в возбужденном состоянии.

Правило Каши – спектр флуоресценции и фосфоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света, так как излучательный переход может происходить только с самого нижнего возбужденного колебательного уровня.

Существуют исключения (например, азулен), когда испускание может происходить как из S2-, так и из S1-состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ведет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обусловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно возможно для тех флуорофоров, которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем.

Квантовый выход Q(φ) – отношение числа излучаемых квантов к числу поглощенных квантов светового потока. Этот показатель показывает эффективность преобразования энергии возбуждения в энергию излучения:

где N – количество излучаемых квантов; N0 – количество поглощенных квантов.

Закон Вавилова – квантовый выход флуоресценции Q не зависит от длины волны возбуждающего света, так как излучательный переход может происходить только с самого нижнего возбужденного колебательного уровня. Но в области наложения спектров поглощения и флуоресценции наблюдается уменьшение квантового выхода флуоресценции (рис. 3.47).

86

Рис. 3.47. Закон Вавилова

Флуоресцентная спектроскопия – эффективный метод исследования динамических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Такая возможность связана в первую очередь с временем жизни возбужденных состояний. Вследствие принципа Франка – Кондона абсорбционная спектроскопия может дать информацию только об усредненных характеристиках основного состояния молекул, поглотивших свет. Поскольку только те молекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектроскопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболочке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекулярную динамику.

В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов, протекающих за время жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участвовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до 100 Å от флуорофора. Хотя может показаться, что 10 нс – слишком короткий промежуток времени, фактически это большое время по сравнению с временем движения малых молекул в жидкой фазе. Вращательная диффузия связанных с белками и мембранами флуорофоров также укладывается в этот временной диапазон.

87

Молекулярная флуоресценция как аналитический инструмент

Аналитические методы, основанные на флуоресцентном детектировании, очень популярны из-за их высокой чувствительности и избирательности вместе с преимуществом пространственного и временного разрешения и возможностью дистанционного обнаружения с использованием оптических волокон.

Количественный анализ, использующий в качестве аналитического сигнала флуоресценцию анализируемого соединения, называется флуориметрией. Метод основан на использовании зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации флуорофора. При низких концентрациях флуорофора в растворе интенсивность флуоресценции (Iф) пропорциональна числу испущенных им квантов (N) и, следовательно, числу поглощенных квантов энергии (N0):

где kф – коэффициент пропорциональности.

Число поглощенных квантов энергии (N0) пропорционально поглощенному возбуждающему флуоресценцию излучению:

где I0 и I – интенсивности падающего и прошедшего через образец потоков света, соответственно. Тогда, в соответствии с основным законом светопоглощения (законом Бугера – Ламберта – Бера):

где ελ – коэффициент поглощения флуорофора при длине волны возбуждающего излучения.

концентрации флуорофора упрощается и превращается в линейную функцию:

88

Таким образом, интенсивность флуоресценции в определенном концентрационном интервале прямо пропорциональна концентрации флуофора. Именно этот концентрационный диапазон используется для количественного анализа, так как градуировочный график в этом случае линеен. Прямая пропорциональность часто соблюдается в пределах трехчетырех порядков концентрации флуорофора. На рис. 3.48 представлена зависимость аналитического сигнала метода от концентрации флуорофора.

Рис. 3.48. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуорофора

Как правило, линейность градуировочного графика соблюдается при концентрациях флурофора до 10-4 моль/л. Основной причиной отклонения от линейности при высоких концентрациях флуорофора является дезактивация возбужденного состояния за счет увеличения доли безызлучательных переходов (концентрационное тушение). Таким образом, концентрация флуорофора в исследуемом растворе порядка 10 4 моль/л – это верхний предел определяемых концентраций для флуориметрии. При использовании этого метода следует следить за тем, чтобы концентрации используемых градуировочных растворов были ниже этого значения, а градуировочный график должен быть линейным и выходить из нуля.

Следует особо отметить, что интенсивность аналитического сигнала в флуориметрии очень велика, по этой причине флуориметрия –

89

высокочувствительный метод с пределом обнаружения порядка 10 8 %. Минимальная концентрация, которую можно определить данным методом (сmin), в среднем составляет 10 9 – 10 8 M. В зависимости от интенсивности флуорофора возможны определения до 0,001 – 0,1 мкг/мл. Так, например, оснащение обычного ВЭЖХ-хроматографа флуориметрическим датчиком позволяет проводить биофармацевтические анализы (например, анализ содержания метаболитов для фармакокинетики), которые требуют высокой чувствительности определений.

Принципиальная схема метода

Спектрофлуориметр (флуоресцентный спектрометр) отличается от спектрофотометра (адсорбционного) тем, что измерение флуоресценции обычно осуществляется под прямым углом. Поэтому используемая кювета (кварцевая) должна быть прозрачна со всех сторон. Прибор имеет два монохроматора (в простейшем случае – светофильтры), первый – на линии возбуждения, второй – на линии излучения (рис. 3.49).

Рис. 3.49. Принципиальная схема флуориметра

Современный спектрофлуориметр имеет два монохроматора, которые позволяют одновременно регистрировать спектры возбуждения и

90