64. Біологічний (експериментальний) метод

Біологічний (експериментальний) метод полягає у зараженні чутливих лабораторних тварин виділеною чистою культурою збудника, досліджуваним матеріалом або введенні бактерійних токсинів і відтворенні типової картини захворювання. Для цього використовують білих мишей, щурів, гвінейських свинок, кроликів. Цим методом визначають і вірулентність мікробів. З діагностичною метою біологічну пробу часто використовують при чумі, сибірці, туляремії, туберкульозі, крупозній пневмонії, поліомієліті, кліщовому енцефаліті тощо

65.Патогенність і вірулентність

Патогенність – це видова здатність певних мікроорганізмів викликати інфекційний процесс. Вірулентність – це ступінь патогенності. Вона є штамовою ознакою і визначається метаболічною активністю бактерійних клітин, їх компонентів і продуктів, які пригнічують захисні механізми господаря. Вірулентність - це якісна, індивідуальна ознака даного штаму. Вірулентність бактерій може бути посилена, послаблена і навіть зовсім втрачена. При цьому інші їх властивості не змінюються. Посилення вірулентності досягають пасажами культури через організм чутливих тварин, різними генетичними методами. Послаблення - шляхом багаторазових пересівів культури на несприятливих середовищах, дією підвищеної температури, бактеріофагів, хімічних речовин, імунних сироваток тощо. Такийпідхід часто використовують при виготовленні живих вакцин та інших бактерійних препаратів.

Фактори вірулентності:

• адгезивність,

• інвазивність,

• токсиноутворення,

• капсулоутворення,

• наявність агресинів.

Одиницi вимiрювання вiрулентностi i методи їх визначення Для характеристики патогенних мікроорганізмів встановлені одиниці вірулентності. DLМ (Dosis letalis minima) - мінімальна смертельна доза. Це та найменша кількість мікробів або їх токсинів, яка при зараженні викликає загибель 90-95 % чутливих тварин. DCL (Dosis certа letalis) - найменша доза, яка викликає смерть 100 % взятих у дослід тварин. LD50 (Dosis letalis50) - доза, що вбиває половину заражених тварин. Вона э найбільш об’єктивною, точною і прийнятою в лабораторних дослідженнях.

66. Комплемент

Комплемент- це складний комплекс білків (близько 20), які формують каскадну ферментну систему. Компоненти комплементу позначаються літерою С із зазначенням порядкового номера (С1, С2, . У нормі у сироватці крові знаходяться найважливіші компоненти комплементу в неактивному стані. Одночасно там присутні і фракції, що здатні пригнічувати певні активовані компоненти цієї системи. Суттю каскадної активації системи комплемента є те, що кожен із перших п’яти компонентів у результаті активації перетворюється на фермент, який розщеплює наступний компонент і надає йому властивостей фермента.С3...С9).

• Альтернативний шлях активації

В організмі постійно, досить повільно в результаті реакції з водою або незначними кількостями протеолітичних ферментів плазми С-3 фракція комплементу активується, що обумовлює утворення активного проміжного продукту її розщеплення - С3b. У присутності іонів Mg C3b може утворити комплекс з іншим компонентом системи комплемента-фактором В. Згодом у цьому комплексі фактор В розкладається фактором D (фермент плазми крові) і виникає комплексна структура C3bBb. C3bBb має значну ферментативну активність і являється “C3-конвертазою”, яка розкладає компонент С3 на С3а і С3b. Ключове значення для реагування системи комплементу має утворений C3b. Якщо він утворився в достатній кількості, то запускається весь подальший процес активації, який завершується лізисом чужерідної клітини. Проте в звичайних умовах С3bBb- конвертаза в розчинах нестабільна і фактор В легко заміщується іншим компонентом - фактором H. В результаті цього утворюється комплекс доступний для атаки фактором I, який в кінці кінців інактивує C3b. Пасивність C3b посилюється за наявності сіалової кислоти, яка стабілізує комплекс C3b-H. При наявності поверхні, яка не має сіалової кислоти, C3b сполучається із фактором В і активується. Поверхні, які сприяють цій активації є на стінках бактерій, на деяких заражених вірусами клітинах, пухлинах чи клітинах, в яких сіалова кислота була зруйнована нейрамінідазою. Деякі мікроорганізми, попадаючи в організм, здатні активувати C3bBb- конвертазу з утворенням великої кількості продуктів розщепленя С3. C3bBb- конвертаза зв’язується вуглеводними ділянками мікробної мембрани, що захищає її від фактору Н. Потім інша речовина - білок пропердин приєднується до зв’язаної C3bBb-конвертази, стабілізуючи її. Фіксована на бактерійній мембрані С3- конвертаза розкладає компонент С3. Продукт цього розкладу C3b ковалентно зв’язується з мембраною. Один активний центр C3bBb дозволяє зв’язатись з бактерією великій кількості молекул C3b. Ця послідовність реакцій, що обумовлена безпосередньо мікроорганізмами і не зв’язана з комплексом антиген - антитіло, і приводить до розщеплення С3. Наступним етапом є активація компонента С5, який, взаємодіючи з C3b зв’язаним з мембраною, стає субстратом для C3bBb і розкладається з виділенням короткого пептиду С5а. В той же час великий фрагмент C5b залишається зв’язаним з мембраною і послідовно зв’язує компоненти С6, С7, С8, утворюючи комплекс, який сприяє правильній орієнтації двох або більше молекул останнього компоненту С9. Це приводить до розгортання молекул С9, їх проникненню всередину ліпідного бішару мембрани і полімеризації в кільцеподібний мембраноатакуючий комплекс. Цей комплекс формує в мембрані трансмембранний канал, через який за рахунок високого осмотичного тиску всередині клітини проникають іони Na і води, що і є причиною лізису клітини (рис. 8). Таким чином руйнуються бактерії, спірохети, рикетсії, чужерідні клітини. В одночас альтернативний шлях активації комплементу може запускатись і антитілами, які покривають сіалову кислоту на клітинних мембранах або протеолітичними ферментами макрофагів. Але система комплементу, крім функції лізису клітин має цілий ряд інших важливих біологічних функцій. Умовно їх можна поділити на три групи. Перша група - реакції адгезії. Клітини, які фагоцитують, мають рецептори до С3b і C3bI, що полегшує прилипання (адгезію) мікробів, на поверхні яких знаходиться C3b. Друга група - утворення біологічно активних субстанцій. В процесі активації комплемента від молекул попередників (С3 і С5) відщеплюються невеликі пептиди С3а і С5а. Вони безпосередньо впливають на фагоцити,викликаючи різку активацію дихання, що приводить до продукціі метаболітів кисню. Крім того, вони являються “анафілатоксинами” і можуть викликати виділення медіаторів із тучних клітин і базофілів. Особливе значення мають хемотаксичні властивості цих молекул і їх вплив на кровоносні судини. В свою чергу С5а є сильним хемотаксичним фактором для нейтрофілів і здатний ефективно впливати на клітини ендотелію капілярів, викликаючи розширення судин і підвищення їх проникливості. Цей ефект підтримується тривалий час лейкотриєном В, який виділяють тучні клітини і активовані нейтрофіли. Третя група - пошкодження мембран. Як вже зазначалось, мембраноатакуючий комплекс вбудовується в мембрану чужерідної клітини і обумовлює її лізис. В той же час система комплементу малоефективна для лізису мембран власних клітин.

• Класичний шлях активації комплементу

Коли в організмі синтезувались на збудник антитіла у систему захисту включається класичний шлях активаціі комплементу (рис. 9). Можна гадати, що антитіло виникло як специфічний чинник для реакції з тими мікроорганізмами, які не здатні запустити альтернативнй шлях активаціі комплемента. Як відомо деякі антитіла (IgG i IgM) в районі шарнірної ділянки мають рецептори до CIq компонента комплемента. Особливо активно зв’язує комплемент IgМ. Але ця здатність антитіл проявляється лише після того, як вони своїми активними центрами з’єднаються з антигенами. Таким чином, антитіло взаємодіючи з мікроорганізмом, зв’язує і активує перший компонент комплементу C1q. Останній об’єднується з С1r i C1s в єдиний комплекс. Активований C1s взаємодіє з наступним компонентом комплемента С4, в результаті розщеплення якого утворюються два його фрагменти: С4а і C4b. C4b можезв’язатись з комплексом антитіло - С1 або з поверхнею мікроорганізма. В присутності іонів Mg компонент С2 здатний утворювати сполуку з С4b, формуючи субстрат для C1s. Виникає комплекс C4b2a, який має виражену конвертазну активність по відношенню до С3. Цей комплекс володіє такою ж специфічністю, як і згадувана нами попередньо конвертаза альтернативного шляху - С3bBb. З цього моменту весь процес подальшої активації комплементу відбувається таким же чином, як і в альтернативному шляху. Одна молекула C3b приєднується до комплекса C4b2a і перетворює його у фермент, який здатний розщепити компонент С5. В кінці кінців через послідовну активацію молекул С6, С7, С8, С9 виникає мембраноатакуючий комплекс, що руйнує мікробну мембрану. Конвертаза класичного шляху активації комплементу теж, як і C3bBb, знаходиться під контролем відповідних факторів (G, C4bp, CR1). Таким чином, сценарій захисту організму виглядає так. Все розпочинається з активації комплементу по альтернативному шляху. Конвертаза C3bBb Закріплюється на поверхні бактерії і розкладає значну кількість С3. Фрагмент С3а виділяється, а багаточисленні молекули C3b зв’язуються з мембраною мікроорганізму. Це активує наступний етап з утворенням С5а і мембраноатакуючого комплексу. В подальшому на сцену подій виходять С3а і С5а. Вони сприяють вивільненню медіаторів із тучних клітин і разом з ними залучають у вогнище проникнення мікроба інші компоненти системи комплемента і поліморфноядерні нейтрофіли. Все це обумовлює посилення кровотоку, розширення дрібних судин, а скорочення клітин ендотелію капілярів дозволяє білкам плазми виходити із судин. Нейтрофіли сповільнюють рух біля стінок капілярів, проникають в отвори між ендотеліальними клітинами і пересуваються за градієнтом концентрації хемотаксичних факторів, поки не зустрінуться з бактерією, покритою C3b. Далі відбувається зв’язування мікроорганізма з C3b рецепторами нейтрофілу, С3а і С5а різко активують клітинне дихання, і миттєво наступає руйнування бактеріальної клітини. Ці процеси обумовлюють відповідні симптоми: гіперемію, набряк, біль. Так, гіперемія є наслідком розширення капілярів, набряк - результат ексудації білків плазми. Описані прояви, а також накопичення нейтрофілів, характерні для гострої запальної реакції. Слід зауважити, що сам комплемент здатний безпосередньо інактивувати деякі віруси й у відсутності антитіл, наприклад ряд ретровірусів. Це можливе тому, що деякі вірусні білки являються рецепторами C1q. Ряд даних свідчить, що віруси можуть активувати комплемент і альтернативним шляхом. Крім перерахованих механізмів, розповсюдження збудника може бути обмежене ферментами, що вивільнюються із пошкоджених тканин і активують згортальну систему крові. До таких речовин відносять С - реактивний білок, сироватковий амілоїдний А - білок, α1 - антитрипсин, α2 - макроглобулін, фібриноген, церулоплазмін і ін. С - реактивний білок при участі іонов кальцію здатний зв’язуватись з деякими мікроорганізмами, до складу мембрани яких входить фосфорилхолін. Комплекс, який при цьому утворюється активує систему комплементу по класичному шляху. При цьому С3b зв’язується з мембраною бактерії, яка легко фагоцитується, дякуючи наявності на поверхні фагоцита рецепторів С3b.