Литература:

1. Современные подходы к лечению гемофилии: Змачинский В. А.// Мед. Новости .-2013-№3.-с.28-31

2. Клинический протокол диагностики и лечения пациентов с гемофилией А и гемофилией В от 30.07.2009 № 756.

3. Болезни крови: Пер. с англ. / Под ред. Б79 М. Жд. Денхэма, И. Чанарина. – М.: Медицина, 1989.

Способ определения проникновения антибиотиков через бактериальную биопленку

Галинская М.В, Ажелис К.О (4 курс, стоматологический факультет), Плотников Ф.В., Кабанова А.А.

Научный руководитель: к.м.н., доцент Окулич В.К.

УО «Витебский государственный медицинский университет»,

г. Витебск

Актуальность. В настоящее время большинством исследователей в области микробиологии признано, что абсолютное множество микроорганизмов в естественных и искусственно созданных окружающих средах существует в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ – биопленок [2]. Экстрацеллюлярный матрикс, состоящий из экзополисахаридов, выделяемых микробами, и несущий важные функции в жизнедеятельности биопленки, занимает 85% массы биопленки. В составе биопленки бактерии защищены от антибактериальных веществ, одним из механизмов устойчивости бактерий в составе биопленки к антибиотикам является снижение проницаемости препаратов через матрикс [3]. В стандартных методах подбора антибактериальных препаратов учитывается чувствительность микроорганизмов к препарату, фармакодинамика и фармакокинетика препарата, однако необходимо так же учитывать, что наличие биоплёнки может препятствовать проникновению антибиотика к очагу инфекции и приводить к клинической неэффективности антибиотикотерапии. Разработка метода качественной оценки проникновения антибиотиков через биопленку in vitro позволит более детально изучить свойства биопленки и позволит повысить эффективность применения антибактериальных препаратов.

Известен способ определения проникновения антибиотиков через биопленку, заключающийся в том, что суточная культура бактерии доводится до определенной концентрации КОЕ/мл по оптической плотности. Биопленку получают следующим способом: 50 мкл полученной бактериальной взвеси добавляют на стерильный поликарбонатный мембранный фильтр диметром 25 мм, который находится на агаре. Чашки инкубируют в течение 48 часов при 35 ⁰С. На полученную таким образом 48-часовую биопленку кладут мембрану диаметром 13 мм и смоченный в бульоне диск. Далее биопленку, образовавшуюся на фильтре, мембрану и диск перемещают на агар с исследуемым антибиотиком. Через сутки диск переносят на агар, содержащий чувствительный к данному антибиотику микроорганизм, инкубируют в течение 18-20 часов, после чего измеряют зону задержки роста и сравнивают ее с контролем, содержащим две мембраны без биопленки [1].

Недостатками способа являются: трудоемкость выполнения методики; необходимость использования специальных мембран и фильтров; отсутствие критерия количественной оценки способности биопленки ограничивать проникновение антибиотиков.

Цель. Разработать простой, доступный способ определения проникновения антибиотиков через биопленку, обладающего четкими критериями оценки и позволяющего назначать рациональную антибиотикотерапию пациентам с гнойно-воспалительными процессами.

Материалы и методы. Штамм бактерий выращивают на агаре при 37 °С в течение 24 часов. Готовят взвесь микроорганизмов 0,5 единиц оптической плотности, определенным с помощью денситометра, что соответствует концентрации 1,5*10⁸ КОЕ/мл. На агар в чашку Петри помещают поликарбонатную мембрану с диаметром пор 0,3 мкм, на поверхность которой добавляют 400 мкл взвеси микроорганизмов, и инкубируют в течение 24 часов. Мембрану с полученной биопленкой переносят на агарозу, содержащую антибиотик, и покрывают слоем чистой поликарбонатной мембраны. Вплотную на чистую мембрану устанавливают пластиковую пробирку с отверстиями на обоих концах, заполненную агарозой. Во время инкубации в течение суток антибактериальный препарат диффундирует через мембраны в столбик агарозы. На расстоянии 1 см от края столбика агарозы, прилежащего к мембранам, формируют диск толщиной 2 мм и помещают на агар с микроорганизмом. Через сутки определяют зону задержки роста. Контролем служит зона задержки роста, полученная при использовании двух слоев чистой поликарбонатной мембраны. При отличии диаметра зоны задержки роста микроорганизма, образовавшейся с использованием биопленки, от контрольной на 3 и более мм констатируют способность биопленки микроорганизма снижать проникновение антибактериального препарата.

Результаты исследования. Проведена апробация разработанного способа, описанного выше.

Пациентка Л. поступила в отделение челюстно-лицевой хирургии с диагнозом хронический одонтогенный остеомиелит. Во время операции секвестрэктомии был произведен забор содержимого секвестральной капсулы для микробиологического исследования. На следующий день возбудитель идентифицирован – Pseudomonas aerugonosa. Выявлено, что биопленка данного возбудителя уменьшает зону задержки роста на 5 мм относительно контроля – проба положительная. Последнее указывает на снижение концентрации антибиотика в гнойной ране в связи с формированием биопленки и на необходимость увеличения дозировки антибактериального препарата, назначенного пациенту, с целью повышения содержания антибактериального препарата в очаге инфекции.

Пациентка М. поступила в отделение челюстно-лицевой хирургии с диагнозом карбункул правой скуловой области. Во время операции вскрытия и дренирования гнойного очага был произведен забор раневого отделяемого для микробиологического исследования. На следующий день возбудитель идентифицирован – Staphylcoccus aureus. Определено, что биопленка данного возбудителя не задерживает прохождение антибиотика относительно контроля, что указывает на неспособность биопленки снижать проникновение антибактериального препарата, следовательно, дозировка антибактериального препарата может остаться без изменений.

Выводы. Положительный эффект предложенного способа состоит в том, что используемые реактивы и оборудование доступны для всех микробиологических лабораторий. Предложенный способ позволяет провести качественную оценку способности биопленки снижать проникновение антибактериальных препаратов и с учетом этого назначать рациональную схему антимикробной терапии. Результатом проведения адекватного антибактериального лечения является купирование гнойно-воспалительного процесса в ранние сроки и сокращение длительности стационарного лечения.