7. Световой микроскоп, микроскопия с иммерсией. Разрешающая способность. Применение. Принципы окраски по Граму. Этапы приготовления микропрепарата.

Для изучения микробов в микроскопе требуется увеличение примерно в 1000 раз. Поэтому используется микроскопы с иммерсионной системой ("иммерсио" - погружение) В состав иммер­сионной системы входит иммерсионный объектив (х⁹⁰) и иммерсионное масло, которым заполняют разрыв между изучаемый предметом и передней линзой иммерсионного объектива. Поскольку по­казатели преломления стекла и масла близки, это позволяет избежать потери световых лучей вследствие их отклонения, и, тем самым, создать оптимальную освещённость поля зрения. Необ­ходимость в концентрации светового пучка обусловлена также и чрезвычайно малым диаметром передней линзы иммерсионного объектива. При микроскопировании необходимо помнить, что объективы "сухой системы" не предназначены для погружения в масло, которое может привести их в негодность. Микроскопия с иммерсионной системой позволяет изучать убитые микробы в ок­рашенном состоянии (их форму, размеры, взаимное расположение, строение бактериальной клет­ки) и дифференцировать одни микробы от других.

Способность микробов окрашиваться различными методами называют тинкториальными свойствами.

В некоторых случаях (изучение морфологии грибов, простейших, других относительно круп­ных объектов в живом неокрашенном состоянии) используется световой микроскоп с затемнённым полем зрения (объективы х⁴⁰ или х⁸) Для микроскопии готовят препараты "раздавленная капля" или "висячая капля".

Правила работы с иммерсионным объективом.

1) поднять конденсор до уровня предметного столика. Открыть ирис-диафрагму

2) Глядя сбоку в верхнюю линзу конденсора и вращая зеркало, найти изображения источника света.

3) Установить иммерсионный объектив

4) На предметный столик поместить препарат с каплей масла и закрепить его клеммами

5) Под контролем глаза макровинтом опустить тубус до соприкосновения линзы объектива с маслом. Осторожно погрузить линзу в масло, не доводя о соприкосновения со стеклом.

6) Глядя в окуляр, макровинтом поднимать тубус до появления изображения в поле зрения.

7) Вращая микровинт не более, чем на половину оборота, добиться четкого изображения.

8) После просмотра препарата макровинтом поднять тубус, снять препарат, опустить конденсор, установить малое увеличение, снять масло с объектива.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зре ния основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в био логическом микроскопе.

Метод Грама — метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Гансом Кристианом Грамом.

По Граму бактерии окрашивают анилиновыми красителями — генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором иода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными в синий цвет и имеющие толстую клеточную стенку, называют грамположительными бактериями, обозначаются Грам (+), — в отличие от грамотрицательных (тонкая клеточная стенка), Грам (−), которые при промывке обесцвечиваются.

Этапы:

1.на участок предметного стекла шапелем нанести микроорганизмы

2.красить генцианвиолетом 2 минуты через фильтровальную бумагу

3.слить краску с микропрепарата

4.налить раствор Люголя на 1 минуту

5.обесцветить препарат, капнув раствор спирта с йодом

6.промыть препарат водой

7.дополнительно окрасить разведённым фуксином 1 мин

8.промыть водой

9.высушить препарат фильтровальной бумагой

10.микроскопировать