21. Получение микробных антигенов, практическое применение.

Принципы получения корпускулярного антигена:

 Корпускулярный АГ – это живые или убитые (инактивированные) клетки в изотонических или буферных растворах. При инактивации клеток пользуются методами, не вызывающими изменения специфичности и снижения иммуногенных свойств.

 Микроорганизмы инактивируют: 

1) высокой температурой, подвергая медленному нагреванию во избежание денатурации белков;

2) химическими веществами (формалином, спиртом и другими);

3) ультразвуком, ультрафиолетом и рентгеновскими лучами. Облучением, в частности, инактивируют опухолевые клетки.

Стандартные антигены из инактивированных патогенных микроорганизмов широко применяются в серологическом анализе при обнаружении антител в сыворотках людей и животных.

С помощью серологических реакций выявляют у исследуемых бактериальных клеток антигенный состав. Взвеси эритроцитов, лимфоцитов, опухолевых клеток в серологических реакциях используют для определения локализованных на их поверхностных мембранах АГ групп крови, СД-маркеров, трансплантационных, опухолеспецифических и других АГ, а также для обнаружения в сыворотках АТ к этим антигенам.

Принципы получения растворимых антигенов

Для изучения природы, функции и иммуногенности отдельных антигенных веществ, входящих в состав клеток или других сложных систем, а также для выявления антител к от-дельным антигенам, необходимо получить антигены в чистом виде. Это многоступенчатый процесс, требующий применения комбинаций различных методов. Антигены прокариот и эукариот получают экстрагированием различными растворителями целых или дезинтегрированных клеток. Так, из целых микробных клеток обычно экстрагируют вещества, которые нековалентно интегрированы в состав клеточной стенки. Например, белок А золотистого стафилококка и липополисахарид наружной мембраны Гр (-) бактерий. Чаще экстракции предшествует дезинтеграция клеток.

Наиболее часто клетки разрушают:

1) механически в специальных приборах (дезинтеграторах и прессах);

2)клетки можно разрушить, воздействуя на них ультразвуком;

3) при помощи ферментов, которые разрывают ковалентные связи, разрушают отдельные клеточные структуры;

4) при помощи детергентов, которые связывают молекулы белков и липидов.

Полученную дезинтегрированную клеточную массу разделяют на отдельные клеточные компоненты, применяя различные виды центрифугирования: дифференциальное, зональное, равновесное в градиенте плотности. Отдельные антигены из дезинтегрированных или интактных клеток, а также из их изолированных структур экстрагируют дистиллированной водой, буферами, растворами кислот, щелочей и т. д.

Экстракты – это сложные смеси антигенов и дополнительных балластных вещест

Антигены выделяют и очищают фракционированием различными методами: избирательным осаждением солями тяжелых металлов, гельфильтрацией, аффинной хроматографией с использованием моноклональных антител. Высокая степень очистки микробных и тканевых антигенов имеет большое практическое значение, так как повышает чувствительность серологических реакций, следовательно, эффективность диагностики. Применяют для серологических реакций - могут быть использованы целые клетки (корпускулярные антигены), например, лимфоциты, плазмоциты, клетки, пораженные вирусами, опухолевые клетки и т.д. (РИФ, РИА, ИФА); бактериальные клетки (РА, РИФ, РИА, ИФА); а также растворимые компоненты (растворимые, молекулярные АГ) для реакции преципитации, нейтрализации, ИФА и других.