1. Нормально-фазова верх

Нерухома фаза більш полярна, ніж рухлива, тому в складі елюента переважає неполярний розчинник:

Гексан: ізопропанол = 95:5 (для малополярних речовин)

Хлороформ: метанол = 95:5 (для среднеполярних речовин)

Хлороформ: метанол = 80:20 (для сільнополярних речовин)

2. Звернення-фазова верх

Нерухома фаза менш полярна, ніж рухлива, тому в складі елюента майже завжди присутня вода. У цьому випадку завжди можна забезпечити повне розчинення БАС у рухомій фазі, майже завжди можливо використовувати УФ-детекцию, майже всі рухомі фази взаємно змішуються, можна використовувати градієнтне елюювання, можна швидко переуравновесіть колону, колону можна регенерувати.

3. Матриці для верх

Як матриць в ВЕРХ використовуються неорганічні сполуки, такі як оксид кремнію (силікагель) або оксид алюмінію, або органічні полімери, такі як полістирол (зшитий дивинилбензола) або поліметакрилат. Силікагель, звичайно, в даний час загальновизнаний.

Основні характеристики матриці:

- Розмір часток (мкм);

- Розмір внутрішніх пір (, нм).

- Отримання силікагелю для ВЕРХ:

- Формування мікросфер полікремневой кислоти;

- Сушка частинок силікагелю;

- Повітряне сепарування.

- Частинки сорбенту:

- Регулярні (сферичні): вище стійкість до тиску, вище вартість;

- Несферичних: нижче стійкість до тиску.

Розмір пір в ВЕРХ - один з найбільш важливих параметрів. Чим менше розмір пір, тим гірше їх проникність для молекул елюіруемих речовин. А отже, тим гірше сорбційна ємність сорбентів. Чим більше часу, тим, по-перше, менше механічна стійкість часток сорбенту, а, по-друге, тим менше сорбційна поверхня, отже, гірше ефективність.

4. Щеплення нерухомої фази

Нормально-фазова ВЕРХ:

- нерухома фаза з пропілнітрільной щепленням (нітрильного);

- нерухома фаза з пропіламінной щепленням (аминной).

Звернення-фазова ВЕРХ:

- нерухома фаза з алкильной щепленням;

- нерухома фаза з алкілсілільной щепленням.

Ендкеппірованіе - захист нещеплених ділянок сорбенту додаткової щепленням "маленькими" молекулами. Гідрофобний ендкеппінг (С₁, С₂): вище селективність, гірше змочуваність; гідрофільний енд-кеппінг (діол): нижче селективність, вище змочуваність.

Іонообмінна хроматографія ґрунтується на явищі обміну іонів між набухлим іонітом і розчином. Іонообмінне розділення суміші іонів визначається різницею їх зарядів, а також іонною силою розчину. Всередині зерен іоніту розділення залежить ще від швидкості дифузії іонів, яка визначається щільністю іоніту (частотою зшивань).

Спорідненість іоніту до іону пропорційна заряду іона і обернено пропорційна радіусу гідратованого іона. Для сильнодисоційованих іонітів їх селективність до іонів може бути показана рядами:

1) Ba²⁺ > Pb²⁺ > Sr²⁺ > Ca²⁺ > Ni²⁺ > Cu²⁺ > Co²⁺ > Zn²⁺ > Mg²⁺ ;

2) Tl⁺ > Ag⁺ > Cu⁺ > Pb⁺ > K⁺ > NH4⁺ > Na⁺ > Li⁺;

3) J^– > NO₃^– > Br^– > SCN^– > Cl^– > F^–.

При хроматографуванні суміші іонів В і С, котрі мають високу­ спорідненість до іоніту, їх ступінь розділення характеризують фактором розділення Kd(B)/Kd(С), де Kd(B) та Kd(С) - коефіцієнти розподілу іонів В та С відповідно між фазою іоніту та фазою розчину.

Коефіцієнт розподілу знаходять як відношення концентрацій іона у фазі іонообмінника до концентрації його у розчині. При Kd>30 хроматографічні зони надто розширюються і розділення вимагає­ більшого часу. Величину Kd можна регулювати, змінюючи концентрацію елюенту або додаючи комплексоутворювальні компоненти. Оптимальне розподілення відповідає стану рівноваги, тому всі фактори (зменшення зерен іоніту, підвищення температури, оптимальна швидкість потоку рухомої фази), які прискорюють досягнення рівноваги, сприяють покращанню розділення.

При виборі іоніту користуються таблицями, в яких наведені характеристики продукованих іонітів різноманітних типів (розмір і форма зерен, обмінна ємність, кислотно-основні властивості; густина, ступінь набухання). Розділення неорганічних сполук проводять на неорганічних іонітах (цеолітах, гідроксидах алюмінію, феруму (ІІІ) тощо) або смолах (співполімерах стиролу з дивінілбензолом).

Для розділення біополімерів (білків, нуклеїнових кислот тощо) застосовують великопористі іоніти - похідні целюлози та полідекстрану. Розділення катіонів відбувається на катіонообмінниках, які містять фіксовані групи HSO₃^–; -PO₃^2– ; -COO^– і катіони як протиіони.

Рухомою фазою при розділенні катіонів найчастіше є розчини хлороводневої та нітратної кислот або їх солей. Досліджувані катіони елююються з колонки внаслідок їх заміщення у фазі іонообмінника катіонами, які містяться в рухомій фазі.

Розділення аніонів здійснюється на аніонообмінниках, які містять фіксовані групи NH₃, NHR₂, NH₂R і аніони як протиіони. Найбільш поширеними елюентами при визначенні аніонів є розчини карбонату або гідроксиду натрію. Час і порядок елюювання катіонів і аніонів визначається їх зарядом і розміром гідратованого іона. Іони затримуються тим сильніше, чим більший їх заряд та розмір гідратованого іона. Елюювальна здатність рухомої фази зростає з підвищенням концентрації іонів, які містяться в ній, та їх спорідненістю до іонообмінника.

В іонній хроматографії найчастіше використовують кондуктометричний детектор, за допомогою якого вимірюють електропровідність елюату. Для зниження фонової електропровідності після розділяючої колонки­ встановлюють компенсаційну колонку, де елюент перетворюється на воду або розчин, який має надто низьку електропровідність. Важливою перевагою двоколонкової іонної хроматографії є низькі межі виявлення іонів і лінійність градуювального графіка в широкому інтервалі їх концентрацій. Це дає змогу використовувати метод стандартів у кількісному аналізі без обов’язкової побудови градуювального графіка. При використанні елюентів з низькою електропровідністю кондуктометричний детектор приєднують безпосередньо до робочої розділяючої колонки. У даному випадку можна використовувати спектрофотометричний, люмінесцентний або полярографічний детектори. Методом іонообмінної хроматографії можна розділяти катіони і аніони, четвертинні основи, аміни, амінокислоти, білки, продукти гідролізу пептидів­, фізіологічні рідини, гідролізати клітинних оболонок мікробів, антибіотики, вітаміни, нуклеїнові кислоти або очищувати воду.

Іонообмінні смоли (іонообмінні полімери, іоніти) - сполуки, іони яких здатні до обміну з іонами того ж заряду і знака, які знаходяться у розчині електролітів. Іонообмінні смоли тверді, нерозчинні, гранично набухаючі в розчинах електролітів та органічних розчинниках зшиті полімери, здатні до електролітичної дисоціації. До складу іонообмінних смол входить матриця (сітчастий полімер) та закріплені на ній іоногенні групи, які несуть електричні заряди, врівноважені рухливими іонами протилежного знака (напр. SO₃H, COOH, РО₃Н₂, N+(CH₃)₂C₂H₄OH, N+R₃, NH₂). Залежно від знака іонів, що обмінюються, розрізняють катіонообмінні смоли, аніонообмінні та амфотерні іонообмінні смоли. До специфічної групи входять комплексоутворювальні (селективні) - гліоксиматні, піридинкарбонові, карбамідні, 8-оксихінолінові та окисно-відновні іонообмінні смоли. Залежно від ступеня дисоціації можуть бути сильнокислотні іонообмінні смоли (RSO₃H), середньокислотні, слабкокислотні (RCOOH) або сильноосновні (багатоатомні гідроксиди тетраалкіламонію), слабкоосновні (поліаміни). Моно- і поліфункціональні смоли містять однотипні або різнотипні іоногенні групи. Існує класифікація Іонообмінних смол за будовою матриці однофазні (гелеві), двофазні (найбільш поширені макропористі на основі співполімерів дивінілбензолу зі стиролом, естерами карбонових кислот або 2,5-метил-вінілпіридином). Кількісною характеристикою іонообмінних смол є обмінна ємність - кількість еквівалентів іонів, які може обміняти 1 г іоніту.

Одержують іонообмінні смоли при полімеризації мономерів, які містять іоногенні групи, полімераналогічним перетворенням сітчастих полімерів (катіоніти - сульфоокисненням, фосфорилюванням, лужним гідролізом; аніоніти - при дії метиленхлориду з наступним амінуванням). Форма випуску іонообмінних смол у вигляді гранул, мембран, стрижнів тощо.

Іонообмінні смоли використовують для очищення, розподілу, концентрування сполук із водних, органічних та газоподібних середовищ, зокрема для очищення лікарських субстанцій та препаратів, стічних вод, вуглеводів, добування рідких металів, як носії у хроматографічному аналізі, як гетерогенні каталізатори.

Розподільна хроматографія - це варіант ВЕРХ, в якому поділ суміші на компоненти здійснюється за рахунок різниці їх коефіцієнтів розподілу між двома незмішуючими фазами: розчинником (рухома фаза) і фазою на сорбенті (нерухома фаза). Історично першими були сорбенти такого типу, які отримували нанесенням рідких фаз (оксідіпропіонітріла, парафінового масла та ін) на пористі носії, аналогічно тому, як готували і готують сорбенти для газорідинної хроматографії (ГРХ).

Проте відразу ж виявилися і недоліки таких сорбентів, основним з яких було відносно швидке змивання фази з носія. За рахунок цього кількість фази у колонці поступово зменшувалася, часи утримування також зменшувалися, на початковій ділянці колонки з'являлися не покриті фазою центри адсорбції, що викликали утворення хвостів піків. З цим недоліком боролися, насичуючи розчинник нанесеною фазою ще до його потрапляння в колонку. Віднесення також зменшувався, коли використовували більш в'язкі і менш розчинні полімерні фази, однак у цьому випадку через труднощі дифузії з товстих полімерних плівок ефективність колонок помітно знижувалася.

Логічним виявилося прищепити хімічними зв'язками рідку фазу до носія таким чином, щоб винесення її став фізично неможливий, тобто перетворити носій і фазу в одне ціле - в так званий щеплено-фазний сорбент.

Перші щеплено-фазні сорбенти були отримані заміщенням гідрофільних силанольних груп, що знаходяться на поверхні силікагелю, в результаті їх реакції з спиртами або амінами. При цьому відщеплюється вода, а залишки спиртів або амінів хімічно прищеплювалися до поверхні силікагелю. Ці так звані «щіткові» сорбенти показали, що з їх використанням дійсно вдається отримати високу ефективність колонок при відсутності винесення фази з колонки і стабільності часів утримування. Однак стійкість таких сорбентів в умовах застосування водних розчинників і навіть слабоосновним або кислих середовищ була низькою: фаза відщеплюється хімічно за рахунок реакції гідролізу.

Надалі зусилля дослідників були спрямовані на пошук реагентів, щеплення яких протікала б досить швидко і повно, а утворилися зв'язку були максимально стійкими. Такими реагентами стали алкілхлорсілани та їх похідні, що дозволили за подібною технологією отримувати щеплено-фазні сорбенти різного типу і з різними як полярними, так і неполярними групами на поверхні.

Успішне застосування сорбентів останнього типу для ВЕРХ сприяло зростанню їх виробництва самими різними виробниками. Кожна фірма виробляла такі сорбенти, як правило, на основі свого виду силікагелю і за своєю технологією, яка зазвичай складає «ноу-хау» виробництва. В результаті велика кількість сорбентів, що називаються хімічно абсолютно однаково (наприклад, силікагель з щепленим октадецілсіланом), мають дуже сильно розрізняються хроматографічні характеристики. Це пов'язано з тим, що силікагель може мати пори ширше або вже, різну поверхню, пористість, його поверхня до щеплення може гідроксильованих чи ні, щепитися можуть моно-, ди-або трихлорсилану, умови щеплення можуть давати мономерний, полімерний або змішаний шар фази, використовуються різні методи видалення залишків реагентів, може використовуватися або не використовуватися додаткова дезактивація гідрофільних силанольних та інших активних груп.

Складність технології щеплення реагентів і підготовки сировини і матеріалів, її многостадийность призводять до того, що навіть отримані за однією технологією на одній фірмі-виробнику партії сорбентів можуть мати дещо різні хроматографічні характеристики. Особливо це стосується тих випадків, коли такі сорбенти використовують для аналізу багатокомпонентних сумішей, що містять речовини, помітно різняться за кількістю і положенням функціональних груп, по роду функціональності.

Враховуючи вищезазначене, завжди слід прагнути до того, щоб при використанні описаної в літературі методики аналізу застосовувати саме той самий сорбент і ті ж умови роботи. У цьому випадку ймовірність того, що роботу не вдасться відтворити, є мінімальною. Якщо ж такої можливості немає, а береться сорбент іншої фірми з аналогічною прищепленої фазою, потрібно бути готовим до того, що буде потрібно тривала робота по переробці методики. При цьому існує ймовірність (і її слід враховувати), що на цьому сорбенті навіть і після тривалої розробки можна не добитися необхідного поділу. Наявність у літературі багатьох описаних методик поділу на давно вироблених старих сорбентах стимулює їх подальше виробництво і застосування з цієї причини. Однак у тих випадках, коли доводиться переходити до розробки оригінальних методик, особливо стосовно до речовин, схильним до розкладання, хемосорбції, перегрупування, доцільно починати роботу на сорбентах, розроблених останнім часом і випускаються за новими, поліпшеним варіантів технології. Нові сорбенти мають більш однорідний фракційний склад, більш однорідне і повне покриття поверхні прищепленої фазою, досконаліші остаточні стадії обробки сорбентів.

Перейдемо тепер до розгляду груп щеплено-фазних сорбентів, що є в даний час основними в ВЕРХ, а також сорбентів з нанесеними фазами для розподільної хроматографії.

Основними перевагами сорбентів з прищепленими нітрильних або аміногрупами в порівнянні з адсорбентами є наступні:

1) внаслідок відсутності гідрофільних силанольних груп ймовірність незворотною адсорбції речовин помітно зменшується,

2) помітно зменшується вплив води на хроматографічне розділення, відпадає необхідність строго контролювати вміст води в розчинниках,

3) швидко досягається рівновага з новим складом розчинника, що дозволяє швидко переходити від методики до методики або успішно використовувати градієнтне елюювання,

4) можливе використання розчинників в широкому діапазоні полярностей, колонки легко можуть бути регенеровані;

5) сорбенти з прищепленими аміногрупами виявляють властивості слабких анионообменниками.

Слід брати до уваги і деякі особливості застосування сорбентів з амінофазамі. Не рекомендується використовувати в якості розчинників і компонентів проб речовини з альдегідні або кетонами групами, так як в цьому випадку можливе руйнування структури прищепленої фази з утворенням підстав Шиффа або зникнення деяких компонентів проб. Амінофаза може бути легко окислена, тому слід виключити дію на сорбент сильних окислювачів. Аналогічно, при використанні нітрильного прищепленої фази слід поцікавитися, чи не реагують з нітрилом вибраний розчинник або компоненти, що входять до складу проби.

Нітрил і амінофази застосовують в біології, медицині, біохімії, фармакології та ін. Ці фази знайшли найбільш широке визнання і випускаються майже всіма виробниками сорбентів Деякі фірми випускають варіанти амінофаз, що містять, наприклад, діетіламіноетільние або диметиламіно-пропильной групи.

Досить широко застосовують також ще одну щеплену полярну фазу - так звану «діольную», або просто «діол», яка містить в складі прищепленої групи дві гідроксильні групи. Її селективність також буде дещо відмінною через іншої хімічної природи полярних груп. Сорбенти з такими щепленими фазами випускають значно менше число виробників.

Розподільна хроматографія з нанесеними фазами

Цей варіант розподільної рідинно-рідинної хроматографії був одним з перших, застосованих для ВЕРХ. Однак на відміну від ГЖХ, де нанесення на носій рідкої нерухомої фази є найбільш популярним методом роботи, що забезпечує більшу частину аналітичних розділень, він не знайшов у ВЕРХ широкого застосування і був витіснений щеплено-фазними сорбентами. Тим не менш, роботи з його використанням проводять, і в деяких випадках застосування розподільчої хроматографії з нанесеними фазами цілком виправдано.

Нерухому фазу і розчинник зазвичай підбирають таким чином, щоб вони були практично взаємно нерозчинні. Це зрозуміло, тому що в противному випадку нанесена фаза буде швидко вимиватися з колонки розчинником. Такими комбінаціями фази і розчинника є, наприклад, трис (ціанетоксі) пропан і гексан, парафінове масло і вода. Однак при роботі з такими системами компоненти зразка, як правило, мають коефіцієнтами розподілу близькими або до нуля, або до нескінченності, тобто або елюіруются з фронтом розчинника без поділу, або затримуються у колонці нескінченно довго. Методи нанесення нерухомої фази можуть бути різними. Фаза може бути розчинена у відповідному розчиннику з низькою температурою кипіння і нанесена методом випаровування, як це роблять в ГЖХ. Фаза може бути нанесена безпосередньо у вигляді рідини або пари. В обох випадках заповнення колонок представляє труднощі, якщо частки сорбенту менше 40 мкм і не можуть бути використані для заповнення «сухим» способом.

Більш популярним є динамічний метод нанесення нерухомої фази. Він полягає в тому, що носій, наприклад силікагель з розміром частинок від 5 до 10 мкм, вносять в колонку звичайним суспензійним способом. На колонку подають заданий об'єм розчину нерухомої фази, потім прокачують розчинник, насичений нерухомою фазою, до встановлення рівноваги. Носій у колонці рівномірно покривається нерухомою фазою, вона знаходиться в рівновазі з насиченим фазою розчинником. Така система буде стабільною і не потребує відновлення через віднесення фази. Насичення розчинника фазою може проводитися в предколонке з тією ж фазою, яка встановлюється після насоса до інжeктоpa і періодично замінної. Недоліки розподільної хроматографії з нанесеними фазами наступні. Неможливо використовувати градієнтну ВЕРХ через віднесення фази. Неможливо працювати у препаративних режимі, тому що зібрані фракції, природно, будуть містити помітну кількість нанесеної фази, що залишається у зразку після упарювання розчинника. Важко змінювати склад розчинника, так як при цьому колонка тривало приходить в новий рівноважний стан з новим розчинником. Утруднене використання підвищених температур для аналізу, так як розчинність нерухомої фази при підвищенні температури помітно зростає. Розчинник, до якого вводиться проба, повинен за складом бути максимально близьким до рухомої фазі, інакше можливі частковий змив веподвіжной фази, хибні піки і порушення процесу хроматографії. Кілька слів про носія і його бажаних характеристиках для розподільної хроматографії з нанесеними фазами. Він повинен мати досить великий обсяг часу, бути при цьому міцним механічно (допускати суспензійний заповнення колонки), мати великі пори і не дуже велику поверхню. Наноситься фаза не повинна бути високов'язкої, щоб не було утрудненого масообміну і зниження ефективності поділу з цієї причини.

Якісний аналіз сполук. Функцією хроматографічної колонки є лише розділення суміші сполук на індивідуальні компоненти. Визначення їх якісного та кількісного складу може бути виконане поза колонкою. Існує два методи якісного аналізу розділеної в хроматографічній колонці суміші: за характеристиками утримання та з застосуванням інших аналітичних прийомів.

На виході з хроматографічної колонки компоненти розділюваної сумішіші проходять крізь детектор та фіксуються у вигляді хроматограми. Остання і є основа для якісного та кількісного визначення складу суміші.

Компоненти суміші, що вимиваються з хроматографічній колонці можуть бути спрямовані до якогось іншого аналізатора або проаналізовані одним з хімічних чи фізичних методів. Можливе поєднання обох методів.

Типовими завданнями якісного хроматографічного аналізу є:

1. Віднесення піків на хроматограмі до однієї або іншої сполуки під час дослідження сумішей, склад яких відомий (наприклад, у практиці роботи хіміків-синтетиків, під час аналізу в лабораторіях або в разі розробки технологічного контролю виробничих процесів.

2. Підтвердження наявності або відсутності в аналізованій пробі яких-небудь конкретних сполук або представників певних класів хімічних сполук.

3. Визначення групової належності всіх або деяких сполук до гомологічного ряду чи до сполук з однотиповою структурою (вуглеводні, спирти, альдегіди, кислоти та ін.).

4. Ідентифікація індивідуальних сполук або компонентів сумішей (у тому числі невідомого походження).

Вирішення першого завдання потребує наявності стандартних сполук чи літературних даних про їх відносне утримування в заданих умовах аналізу не є тяжке та може бути доручено людині, яка тільки приступає до освоєння методів та можливостей газохроматографічного аналізу.

Під час спроб вирішення за допомогою газохроматографічних методів трьох наступних завдань, перерахованих за порядком ускладнення, часто приходять до неоднозначних результатів. Наприклад, можуть бути отримані дані, які свідчать лише про відсутність у пробі тих чи інших сполук, але не гарантують присутність інших. Найбільш складним є завдання, яке пов’язане з ідентифікацією компонентів складних сумішей, що складаються з десятків, або навіть сотень сполук, синтезованих природними об’єктами, чи таких, які їх забруднюють (наприклад, під час хроматографічного вивчення мікроорганізмів, вивчення запаху харчових продуктів, аналізу стічних вод, повітря виробничих приміщень).

Ідентифікація сполук за допомогою величин утримування. Час утримування та пропорційний йому утримуваний об’єм можуть бути покладені в основу якісної ідентифікації сполук у зв’язку з тим, що ці величини визначаються властивостями системи сорбат-сорбент.

Для якісної характеристики використовуються як абсолютні, так і відносні величини утримування. Однак використання абсолютних величин утримування, наприклад питомого утримуваного об’єму Vg, може призвести до отримання ненадійних даних, які під час хроматографування однакових сорбатів на однакових сорбентах можуть сильно впливати випадкові фактори (коливання температури та ін.).

Значення відносних утримуваних об’ємів можна знайти в таблицях ідентифікації досліджуваних сполук і порівняти отримані дані з табличними. Звичайно, обраний адсорбент, умови проведення експерименту, сполука, взята за стандарт, повинні повністю збігатися з наведеними для даної сполуки в таблиці.

Для отримання більш вірогідних даних застосовують метод тестерів: величини утримування (найпростіше часу утримування) для аналізованих сполук порівнюють з величинами утримання чистих сполук (тестерів), які хроматографують за тих самих умов. Збіг величин утримування свідчить про ідентичність сполук, окрім випадків, коли різні за природою сполуки мають однакові величини утримування. Для перевірки слід провести повторний аналіз на колонці, заповненій іншим адсорбентом. Повторний збіг величин утримування є достатньо переконливе доведення ідентичності аналізованої сполуки сполуки-тестеру.

Метод тестерів може бути видозмінено. При цьому припущений компонент суміші додають у досліджувану суміш під час повторного її хроматографування. Якщо додана сполука ідентична аналізованій, то на повторній хроматограмі кількість піків залишиться незмінною і при цьому площа одного з них збільшиться. У цьому випадку сполука, площа піку якої збільшилась, може вважатися ідентичною введеної до суміші сполуки-тестеру.

Комбінований метод. У разі хроматографічного аналізу може бути важко здійснити вимивання речовин, які сильно сорбуються. У такому випадку необхідно застосовувати комбінований метод. За цим методом спочатку проводять звичайний проявниковий аналіз, протягом якого з колонки вимивають речовини, які відносно слабо сорбуються . Потім у розчинник додають сполуки, які сорбуються сильніше всіх компонентів суміші або замінюють розчинник на сполуку, яка сильно сорбується і витискає з шару сорбенту компоненти суміші, що залишилися.