7 Биохимический контроль
Отбор культуры для анализа проб производится в асептических условиях в ламинарном шкафу МВ 602WSL. Из колбы с культурой в пробирку налить 5 мл инокулята, колбу закрыть и снова поставить на качалку.
7.1 Измерение оптической плотности
Изменение биомассы клеток в процессе развития культуры регистрируется оптическими показателями культуры.
Для измерения оптической плотности необходимо периодически отбирать пробы культуры: 1 мл пробы развести 5 мл дистиллированной воды и перемешать. Разведенную пробу залить в кюветы на 1 мм и измерять в фотометре «КФК-2МП» (рис.7). В качестве контроля использовать дистиллированную воду. Измерение проводить при длине волны в 440 нм.
Рисунок 7 - Фотометр «КФК-2МП».
7.2 Измерение количества азота
Необходимо отобрать 2 мл инокулята, открутить на центрифуге «Hanil Micro-6» (рис. 9) до полного осаждения пробы, после чего 1 мл надосадочной жидкости залить 10 мл дистиллированной воды. Добавить 1-2 капли 33% KOH и 0,5 мл реактива Нестлера. Результат наблюдать по цветовой реакции (рис. 8).
0 1 2 3
Рисунок 8 - Качественная реакция на аммиачный азот
0 – добавить 10 мл NH4Cl; 1 – добавить 6 мл NH4Cl; 2, 3 – достаточное количество азота
Рисунок 9 - Центрифуга «Hanil Micro-6»
7.3 Определения концентрации фруктозы в инокуляте
Необходимо отобрать 2 мл инокулята, открутить на центрифуге «Hanil Micro-6» до полного осаждения пробы, после чего 0,5 мл надосадочной жидкости разбавить в 50 мл дистиллированной воды. Далее 1 мл разбавленной культуры внести в пробирку, добавить 1 мл спирта резорцина и 3 мл разбавленной соляной кислоты с концентрацией 5:1 по отношению к воде. В качестве контроля использовать воду. Приготовленные пробирки поместить на водяную баню при 80оС на 20 минут. По истечении времени пробы остудить, измерить оптическую плотность на фотоколориметре КФК-2МП, и λ=540 нм (длина оптического пути 10 мм), концентрацию фруктозы определять по калибровочному графику.
Оптимальная концентрация при восполнении субстрата фруктозы - 20 г/л.
7.4 Определение концентрации глюкозы в инокуляте
Для определения концентрации глюкозы в инокуляте необходимо открутить 2 мл культуральной жидкости на центрифуге «Hanil Micro-6» до полного осаждения пробы, после 1 мл культуральной жидкости разбавить дистиллированной водой в соотношении 1:4. В 3 пробирки в отдельности внести по 40 мкл: дистиллированная вода (контроль), калибратор из набора «Глюкоза - ФКД», разбавленная надосадочная жидкость. После во все три пробирки добавить по 2 мл ферментно-хромогенной смеси (2 мл). Оставить на 25 минут (после 5-10 минут после добавления ФХС взболтать пробирки). Оптическую плотность измерить на фотометре «КФК-3», кюветы на 5 мм, с длинной волны 490 нм. Результат рассчитать по формуле (1):
Кол-во глюкозы (г/л) = (О.П.опыт/О.П.калибратор)*9 (1)
Оптимальная концентрация при восполнении субстрата глюкозы - 20 г/л.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изложенная в данном учебном пособии технология является основой для получения посевного материала и позволяет реализовать процесс биосинтеза, как в лабораторных, так и в промышленных ферментерах. Только строгое выполнение всего комплекса мероприятий и своевременного контроля позволит сохранить и приумножить качественную музейную культуру, обеспечит биотехнологический процесс чистым посевным материалом, и конечно, является основой и залогом экономической стабильности любого биотехнологического предприятия.
Данные методические указания разработаны для проведения лабораторных практикумов и работ по направлению «Культивирование микроорганизмов в лабораторных ферментерах».