4.2 Разведение микробной культуры
Все работы ведутся в асептических условиях в ламинарном шкафу.
Для обеспечения роста микробного штамма, необходимо производить разбавление культуры при достижении оптической плотности около 4 г/л.
Для этого необходимо разлить культуру с помощью стерильного мерного цилиндра 500 мл в стерильные колбы на 2 л и разбавить полной средой Шлегеля 500 мл так, чтобы после разведения оптическая плотность в полученном инокуляте была не ниже 1 г/л.. Колбы, закрытые ватно-марлевыми пробками, размещают в шейкере инкубаторе Innova 44, и цикл выращивания продолжают до достижения культурой 5 г/л. По достижению необходимой плотности, перед посевом инокулята в ферментер, производят микробиологический контроль (п. 5).
5 Микробиологический контроль
Все работы ведутся в асептических условиях в ламинарном шкафу.
При подготовке посевного материала (инокулята) микробиологический контроль производят 2 раза. Первый – после смыва музейной культуры в колбы, второй – перед посевом бактерий в ферментер.
Рисунок 3 - Осуществление микробиологического контроля
в ламинарном шкафу МВ 602WSL.
Для проверки стерильности посевного материала и питательных сред необходимо производить высев на агаризованную среду.
Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производить стерильно над пламенем горелки.
Перед посевом всю посуду проверить на целостность. Для посева бактерий применять пептонный агар.
Работа по микробиологическому контролю включает четыре этапа:
- подготовка плотной питательной среды для посева;
- приготовление разведений;
- посев на плотную питательную среду в чашки Петри;
- визуальная оценка выросших колоний.
Присутствие хотя бы одной посторонней колонии в высеве с данной партии посевного материала выбраковывает всю партию.
5.1 Подготовка плотной питательной среды для посева.
В приоткрытые стерильные чашки Петри (3-4 шт) налить из колбы расплавленную в микроволновой печи стерильную и охлажденную агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки закрыть и оставить в ламинаре пока не застынет агар, в это время приготовить разведения культуры микроорганизмов.
5.2 Приготовление разведений.
Количество микроорганизмов в посевном материале велико и для получения отдельных колоний производят ряд разведений.
Разведения готовят в стерильной водопроводной воде. Для работы необходимо 7 стерильных пробирок, закрытых ватно-марлевыми пробками. Стеклянной пипеткой в каждую пробирку из колбы вносить по 4,5 мл водопроводной воды. Далее из колбы с посевным материалом стеклянной пипеткой с помощью груши отобрать 1 мл культуры в первую пробирку, содержимое тщательно перемешать, и уже из первой пробирки 0,5 мл разбавленной культуры переносить в последующую, так разведения повторяют 6 раз. На рис. 4 представлено проведение разведений и посева.
Для приготовления каждого разведения обязательно использовать отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата.
Рисунок 4 –Проведение разведений и посева