Модуль6

1. Области применения биологических агентов, полученных методами генетический инженерии.

С помощью этих методов возможно получение новых высокопродуктивных продуцентов белков и пептидов человека, антигенов, вирусов и др.

Развитие данных направлений позволит человек модифицировать организмы по своему желанию под конкретные цели и задачи. Эта находит своё применение во всех сфера сельского хозяйства, животноводства, медицине.

Конструирование организмов с заданными свойствами позволит существенно улучшить множество промышленных процессов и отказаться от вредных химических агентов в пользу более экологичных биологических аналогов.

2. Технологии генетического конструирования организмов in vitro. Источники ДНК для клонирования генов / рестрикция, ферментный и химико-ферментный синтез генов/. Методы введения ДНК. Экспрессия генов в рекомбинантных ДНК.

Основным инструментом генетического конструирования организмов стали две группы ферментов – рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы) и лигазы.

Первая группа необходима для получения однородных фрагментов ДНК, вторые – для их соединения. Рестриктазы и лигазы в совокупности с другими ферментами (нуклеазами, обратной транскриптазой, ДНК-полимеразой и др.) обеспечивают проведение всех процедуры внедрения гена в клетку.

Техника генетического конструирования in vitro включает следующие процедуры:

- получение нужного гена;

- встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);

- введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент;

- идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.

- Схема генетического конструирования

При введении в бактериальную клетку ДНК разрушается под действием ферментов. Чтобы этого не происходило, используют специальные векторы ДНК, способные при введении в клетку существовать автономно, а при делениях клетки – реплицироваться.

Вектор несет в своем составе генетический признак, необходимый для последующего распознавания и отбора трансгенных организмов. Обычно в качестве маркерных генов используют гены устойчивости к антибиотикам. В качестве векторов используют плазмиды и вирусы.

Введение изменённой днк в клетку осуществляется путем трансформации или конъюгации.

Трансформация – это процесс изменения генетических свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК.

Конъюгация – один из способов обмена генетического материала, при котором происходит однонаправленный перенос генетической информации от донора к реципиенту. Этот перенос находится под контролем особых конъюгативных плазмид.

Скрининг клеток, приобрётших признак проводят по наличию в них вектора и гена мишени.

3. Генная инженерия промышленно-важных продуцентов инсулина, соматотропина, интерферонов.

Получение рекомбинантного инсулина.

Способ получения рекомбинантного инсулина человека бактериями, предложенный учёным Нильсоном.

Способ заключается в культивировании штамма-продуцента Е. coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических имуноглобулина связывающих домена стафилококкового белка А.

Удалось добиться высокой продуктивности штамма-продуцента за счет использования богатой питательной среды.

Выход проинсулина составлял 3 г/л питательной среды.

Схема выделения заключалась в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительного сульфитолиза проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией на имуноглобулины, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией.

Биосинтез соматотропина.

При химико-ферментном синтезе ДНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, поэтому был выбран специальный путь клонирования. На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестиктазами получали последовательность, кодирующую всю аминокислотную последовательность гормона, кроме первых 23 аминокислот. Далее клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий этим 23 аминокислотам со стартовым ANG кодоном в начале. Два полученных фрагмента соединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Сконструированный ген трансплантировали в E. coli. Синтезированный в бактериях гормон обладал требуемой молекулярной массой, не был связан с каким-либо белком; его выход составлял около 100 000 молекул на клетку. Гормон, однако, содержал на N-конце полипептидной цепи дополнительный остаток метионина;

Получение интерферонов.

Лейкоцитарный интерферон - видоспецифический белок, синтезируемый лейкоцитами человека в ответ на воздействие вируса-интерфероногена. Интерферон не обладает избирательной противовирусной активностью и действует практически на все вирусы.

Генноинженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения интерферона включает следующие этапы:

1) обработка лейкоцитарной массы индукторами интерферона;

2) выделение из обработанных клеток смеси иРНК;

3) получение суммарных комплементарных ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы;

4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование;

5) отбор клонов, содержащих гены интерферона;

6) включение в плазмиду сильного промотора для успешной транскрипции гена;

7) экспрессия гена интерферона, т.е. синтез соответствующего белка;

8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии.

4. Клеточная инженерия. Получение биологических агентов методами клеточной инженерии in vivo.

Конструирование in vivo (клеточная инженерия) это технология получения и выделение мутантов с использование различных способов обмена наследственной информацией живых клеток.

Основой клеточной инженерии является слияние неполовых клеток (гибридизация соматических клеток) с образованием единого целого.

Слияние клеток может быть полным, или клетка-реципиент может приобрести отдельные части донорской клетки (митохондрии, цитоплазму, ядерный геном, хлоропласты и др.).

К рекомбинации ведут различные процессы обмена генетической информацией живых клеток (половой и парасексуальный процессы эукариотических клеток; конъюгация, трансформация и трансдукция у прокариот, а также универсальный метод – слияние протопластов).

У бактерий обмен генетической информацией происходит в результате взаимодействия конъюгативных плазмид (конъюгации).

Пример клеточной инженерии для получения клонированного организма

5. Мутагенез; методы получения и выделения мутантов.

Мутагенез — внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций).

Для выделения мутантов используют методы позитивной и негативной селекции.

1.Позитивная селекция. Используют селективную среду, на которой растут только мутантные колонии. Например, для поиска резистентных к пенициллину мутантов использую среду с пенициллином.

2.Негативная селекция. Используется для выявления мутантов, утративших признаки (ауксотрофы) по сравнению с родительскими клетками (прототрофными). Ауксотрофные мутанты утрачивают способность синтезировать жизненно важные нутриенты. Для их выявления используют метод реплик и минимальные питательные среды.

6. Гибридизация эукариотических клеток.

Гибридизация — процесс образования или получения гибридов, в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной клетке. Образование гибридов у дрожжей, грибов и водорослей происходит в результате слияния клеток.

7. Плазмиды и конъюгация у бактерий. Фаги и трансдукция.

Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), стабильно наследуемые. Плазмиды разделяют на конъюгативные, способные самостоятельно перенестись в реципиентные клетки с помощью конъюгации, и неконъюгативные, не обладающие этим свойством.

Трансдукция – перенос генетической информации от клетки донора к клетке реципиента, который осуществляется фагом. Фаги могут быть вирулентными – лизирующими зараженные ими бактерии – или умеренными – образующими с клеткой-хозяином своеобразный симбиоз.

8. Техника слияния протопластов.

Термин «протопласты» применяют для обозначения структур, которые образуются после полного удаления клеточной стенки у клеток растений, микроорганизмов, животных.

Для получения протопластов используют несколько методов:

1) выращивание клеток на средах с антибиотиками, высокими концентрациями аминокислот. В результате нарушаются процессы биосинтеза клеточной стенки;

2) основной метод – ферментный лизис клеточной стенки, например, лизоцимом.

С помощью слияния протопластов можно получать генетические рекомбинанты у тех видов и штаммов микроорганизмов, у которых не обнаружены собственные системы обмена наследственной информацией и которые в естественных условиях никогда не скрещиваются между собой.

9.Гибридомы. Получение и применение моноклональных антител.

Моноклональные антитела — это иммуноглобулины, синтезируемый одним клоном клеток. Моноклональное антитело связывается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена. Гибридомная технология — слияние с помощью полиэтиленгликоля лимфоцитов селезенки предварительно иммунизированных организмов определенным антигеном с миеломными (раковыми) клетками, способными к бесконечной пролиферации (делению).

Гибридомы представляют собой бессмертные клоны клеток, синтезирующие моноклональные антитела. С их помощью можно определить любое иммуногенное вещество.

В медицине меченные изотопами или иным способом моноклональные антитела можно использовать для диагностики рака и определения локализации опухоли, для диагностики инфаркта миокарда. Получены моноклональные антитела к различным возбудителям: малярии, трипаносомозу, лейшманиозу, токсоплазмозу и др.