1.Протеомика. Современные технологические платформы анализа белков. Методы масс-спектроскопии.

Немаловажным элементом, обеспечивающим высокие жизненные стандарты в

таких странах являются сети лабораторий разного профиля, контролирующих

состояние объектов окружающей среды, качества пищевых продуктов, лекарственных

препаратов, сельскохозяйственной продукции, лабораторий судебной и судебно-

медицинской экспертизы, и других лабораторий.

Протеом, определяемый как полноценный набор белков клетки, микроорганизма или биологической жидкости организма, сегодня находится в центре внимания научно-исследовательских групп и фармацевтических компаний. Основной задачей ученых, организаторов здравоохранения, практических врачей является анализ и интеграция информации, полученной в области фундаментальных геномных, протеомных исследований на основе новых технологических платформ с последующим внедрением их в клиническую практику. До недавнего времени неизвестные белки и протеомы идентифицировали с использованием либо агента, специфически связывающегося с белком (как правило, антитело), либо секвенирование белка ступенчатой деградацией по Эдману. Ни один из этих методов не подходит для анализа целого протеома, когда необходимо быстро охарактеризовать тысячи белков. В начале 1990-х годов выяснилось, что быстрая идентификация белков может быть достигнута масс-спектрометрически. Масс-спектрометрия (МС) используется для определения молекулярных масс, но очень долгое время этот метод не удавалось использовать для анализа больших молекул, включая белки, поскольку процесс ионизации приводит к фрагментации молекулы. В результате разработки методов мягкой ионизации, таких как матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ, т.е. лазерная десорбция при содействии матрицы) и электроспрей-ионизация, появилась возможность определять массы больших молекул.

Масс-спектрометрический анализ представляет собой физический метод, основанный на измерении массы заряженных частиц материи. МС отличается от других аналитических физико-химических методов тем, что непосредственно детектирует сами частицы вещества, а оптические рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами. МС измеряет отношение m/z.. Можно получать данные о структуре вещества. Результат (МС-масс-спектрограмма) служит для идентификации молекулы. МС можно рассматривать как совокупность трех процессов: ионизации, разделения ионов по массам и регистрации образующихся ионов. Многочисленные методы ионизации (электронный удар, химическая ионизация, бомбардировка быстрыми атомами, ESI, MALDI) можно сочетать с различными способами разделения ионов. Принципиальная схема устройства масс-спектрометра включает в себя инжектор (дозатор) проб, ионизатор, анализатор масс и детектор ионов. Сначала проба впрыскивается в ионизатор, где молекулы образца ионизируются. Затем ионы образца анализируются и регистрируются. Чтобы предотвратить столкновение с молекулами газа, ионизатор, анализатор масс и детектор ионов обычно работают в вакууме. В настоящее время различают несколько способов ионизации: «электроспрей» (API, ESI), основанный на методе электростатического распыления, блоки химической (APCI) или фотохимической (APPI) ионизации, комбинированный способ, в котором параллельно осуществляются два типа ионизации API + APCI и метод матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) (или лазернодесорбционная ионизация в матрице).

Метод ионизации, получивший название «электрораспыление» (ESI), часто называют электродинамическим. Ионизация происходит при взаимодействии

сильного электростатического поля с поверхностью жидкости на конце капиллярной

трубки. В исследуемой жидкости должны быть ионы. Поэтому обычно добавляют

небольшие количества ионных солей или другие соединения, которые могут привести к

образованию ионов. Характерной чертой APCI является ионизация вне вакуумной системы MS, а анализируемые вещества в потоке газа-носителя (азот, аргон) поступают в анализатор через специальный интерфейс. В качестве источника ионов используют коронный разряд. Масса определяемых веществ при APCI не превосходит 1 500 Da. Главным

преимуществом APCI является незначительная, по сравнению с ESI, ионная супрессия. К

недостаткам метода относится трудность определения термонестабильных веществ. С 1970 г. в МС-анализе начали применяться лазерные устройства для получения

прямой десорбции интактных молекулярных ионов из конденсированных газовых фаз. В

этот период исследований тонкий слой образца наносился на металлическую поверхность

и подвергался воздействию пульсирующего лазера. Однако получавшиеся масс-спектры

имели малую интенсивность, так как энергия лазера была недостаточной, чтобы вызвать

молекулярную фрагментацию молекул образца. Таким образом, MALDI (лазернодесорбционная ионизация в матрице) находила применение только для биомолекул с Mw ниже 1 000 Da. В соответствие с конструкцией анализатора масс существует пять основных

типов МС: 1) секторные магнитные и (или) электрические МС, в которых ионы,

покидающие источник ионов, ускоряются и проходят через сектор, в котором магнитное

или электрическое поле прикладывается перпендикулярно к направлению их движения.

Поле изгибает траекторию полета ионов и принуждает ионы с различным отношением m/z

разлетаться веером. В сканирующем анализаторе масс изменяют силу электрического или

магнитного поля, при этом каждый раз регистрируется только одна масса. В

несканирующем анализаторе все массы регистрируются одновременно с помощью многоканального детектора.

2) квадрупольные МС, в которых пучок ионов с помощью электрического поля

разгоняется до высокой скорости и проходит сквозь квадрупольный анализатор масс,

состоящий из четырех металлических стержней. К этим стержням прилагается

напряжение постоянного или переменного тока таким образом, что в каждый момент

времени сквозь анализатор пролетают ионы только с одним соотношением массы к заряду

– m/z. Чтобы просканировать различные m/z, напряжение тока варьирует.

3) МС и ионной ловушкой. Ионные ловушки могут работать только в периодическом режиме: накопление ионов, затем их анализ. Анализ может быть проведен либо путѐм сканирования масс, либо путѐм изоляции определенного иона, с последующим

изучением его фрагментации, а также масс-фрагментографии нескольких поколений его

дочерних ионов с целью получения информации. Другим режимом работы ловушки является процесс резонансного захвата выбранного. При этом при помощи радиочастотных полей из всей массы ионов, находящихся в ловушке выделяется и удерживается ион с определенным отношением m/z. Этот процесс занимает десятки микросекунд. Следующий этап начинается с повышения напряжения на одном из электродов, из-за чего захваченному иону сообщается дополнительная энергия. Ион испытывает соударения с атомами гелия, приводящие к его фрагментации.

4) Время-пролѐтные МС. Времяпролѐтный масс-детектор используется для

идентификации неизвестных соединений, а также для количественного анализа. Обеспечивает гораздо более точное измерение масс ионов и демонстрирует существенно более высокую скорость сбора данных. Принцип действия этих приборов

основан на измерении времени свободного дрейфа ионов разной массы от ионного

источника до детектора и вычисления их m/z на основе этих данных.

5) МС с преобразованием Фурье (ПФ) («ион-циклотрон-резонансный МС»).

Принцип работы МС основан на том, что ионы, инжектированные в ячейку анализатора,

раскручиваются и вращаются на низких орбитах. При приложении высокочастотного

сигнала ионы резонансно ускоряются и вращаются на более высоких орбитах.

Высокочастотный сигнал, порождаемый раскрученными ионами, измеряется и

подвергается преобразованию Фурье.

Замечательной особенностью МС-ПФ является высокое разрешение, которое

обычно превышает 100 000.

3.Белки - маркеры в кардиологии. Группы сердечно - сосудистых заболеваний. Атерогенез. Патобиохимия атерогенеза. Атеросклероз. Маркеры атеросклероза.

В группу сердечно-сосудистых заболеваний включают: ишемическую болезнь сердца, цереброваскулярную болезнь и поражение периферических артерий. Ведущая роль в патогенезе ССЗ принадлежит атеросклерозу. В структуре смертности от ССЗ около 85-90% приходится на долю инсульта мозга и ИБС.

- Нарушение липидного обмена. Риск развития АС связан с повышенным содержанием в кровотоке ЛПНП и ЛПОНП при сниженном кол-ве ЛПВП. Отложение ЛПНП в субэндотелиальном слое сосудов.

- Накопление холестерин-ЛПНП в субэндотелиальном слое сосудов. Предпосылкой для развития атерогенеза является накопление ЛПНП в интиме сосудов.

- Окислительный стресс (окисление ЛПНП). При нем в фагоцитах активируются НАДФ-Н оксидаза и миелопероксидаза, что в дальнейшем приводит к резкому увеличению концентрации активных форм кислорода. АФК повреждают сосудистый эндотелий и окисляют липопротеины субэндотелиального слоя.

- Инициация иммунного ответа в интиме сосудов. Окисленные фосфолипиды, входящие в состав окси-ЛПНП, гидролизуются PLA-2 с образованием лизофосфотидилхолина и окисленных жирных кислот. Эти в-ва явл-ся медиаторами воспаления.

- Проникновение лейкоцитов в субэндотелиальный слой.

- Воспалительный процесс в интиме сосудов. Хемотаксис и проникновение моноцитов в субэндотелиальное пространство.

- Формирование пенистых (ксантомных) клеток. Моноциты, проникшие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги, затем при участии СРБ распознают окси-ЛПНП как чужеродный агент. После эндоцитоза макрофаги либо возвращаются в кровоток и, таким образом, выводят окси-ЛПНП из интимы, либо транспортируются в в заполненные ЛПНП пенистые клетки.

- Образование фиброзной оболочки атеромы. Гладкомышечные клетки мигрируют в интиму, где пролиферируют и образуют фиброзную оболочку вокруг скопления ксантомных клеток.

Маркеры атеросклероза.

1,2 Стадия- нарушение липидного обмена. Накопление холестерин-ЛПНП в субэндотелиальном слое сосудов. Маркеры: ЛПНП, ЛПВП, ЛПОНП, Апо-А-1, Апо-В, индекс атерогенности.

3 стадия окислительный стресс. Маркеры: МПО, общая антиоксидантная способность, окси-ЛПНП.

4-6 стадия инициация иммунного ответа в интиме сосудов. Проникновение лейкоцитов в субэндотелиальный слой. Воспалительный процесс в интиме сосудов. Маркеры: sPLA2, IL-1, VCAM-1, TNF-альфа, IL-8, NO

7-8 стадия формирование пенистых клеток. Образование фиброзной атеромы. Маркеры: hsCRP, PDGF, тромбоспондин-2.

4.Липидный обмен. Дислипопротеинемии. Молекулярные маркеры дисфункции липидного обмена.

Уровни в крови ХС и триглицеридов являются наиболее важными показателями состояния липидного обмена у больных. Исследование ЛПНП-ХС осуществляют с целью фенотипирования дислипротеинемий. ЛПНП-ХС являются основной транспортной формой ХС для нужд клеток сосудистой стенки, а при патологических состояниях

– источником накопления его в стенке сосуда. Именно поэтому при II типе гиперлипопротеинемии, характеризующейся высоким уровнем ЛПНП-ХС. ЛПНП являются главной транспортной формой для эндогенных триглицеридов. Увеличение

содержания ЛПОНП-ХС всегда коррелирует с увеличением уровня триглицеридов.

Определение уровня ЛПОНП-ХС в клинической практике используется главным

образом для дифференциальной диагностики дислипопротеинемий.

Апо-А - гликопротеин, связанный дисульфидными мостиками с аполипопротеином В (Апо-В). Эти два аполипопротеина, связываясь с липидами, образуют липопротеиновую частицу А, обозначаемая Лп-А.

Лп-А - это атерогенная частица. Лп(а) очень похожа на ЛПНП; основным отличием между ними служит наличие в составе Лп(а) Апо-А, ковалентно связанного с Апо-В. Показано, что первичная структура активных участков Апо-А имеет высокую степень

гомологии (до 98%) с белками каскада коагуляции: плазминогеном, тканевым активатором плазминогена и фактором XII. Это структурное сходство обеспечива-

ет участие Лп(а) в процессах атеротромбогенеза путем прикрепления тромба в участках сосудистой стенки, богатых Лп(а). Повышенная концентрация Лп(а) является наследуемым фактором риска для ИБС.

Апо-А-1 – основной белок переносчика «хорошего холестерина» - ЛПВП, кот. Возвращает избыточный холестерин, образующийся в тканях, обратно в печень. На одну ЛПВП приходится одна молекула Апо-А-1.

Апо-В – основной белковый компонент ЛПНП, ЛПОНП, ЛППП и хиломикронов. Сущ. в виде 2-ух изоформ: Апо-В-48 и Апо-В-100. Апо-В-100 способствует проникновению ХС в сосудистую стенку.

Липопротеин липаза (LPL) – фермент, участв. в метаболизме липопротеинов, где много триглицеридов: она гидролизует триглицериды хиломикрона и ЛПНП в кровотоке. LPL синтезируется в большинстве тканей организма, кроме печени, где экспрессируется липаза.

5. Маркеры дисфункции эндотелия

Дисфункция эндотелия имеет значение в развитии тромбоза. Эндотелиальная выстилка сосудов регулирует местные процессы гемостаза, пролиферации. Миграции клеток в сосудистую стенку и сосудистый тонус.

Эндотелий-внутренняя выстилка сосудов. Эндотелий интимы сосудов выполняет барьерную, секреторную и гемостатическую функцию.

Эндотелиальную дисфункцию можно определить как неадекватное образование в эндотелии различных биологически активных веществ. Одним из методов оценки выраженности эндотелиальной дисфункции является оценка содержания в крови этих веществ или исследование содержания в крови факторов повреждающих эндотелий.

К факторам риска повреждающих эндотелий относятся:

-гиперхолестеринимия

-гипергомоцистеинемия

-повышенный уровень цитокинов

Вещества эндотелиального происхождения

-Факторы постоянно образующиеся в эндотелии и выделяющиеся из клеток в кровь (простоциклины)

-Факторы накапливающиеся в эндотелии и выделяющиеся из него при стимуляции ( фактор Виллебранда, Р-селектин)

-Факторы синтез которых в нормальных условиях практически не происходит

Факторы повреждающие эндотелий:

1 Гомоцистеин- серосодержащая аминокислота, образующаяся в метаболическом цикле метионина.

Гомоцистеин обладает выраженным токсическим действием на клетку поэтому существуют механизмы выведения ГЦ из клетки. Для превращения ГЦ обратно в метионин, требуется активная форма фолиевой кислоты. Мутация в гене, кодирующем MTHFR- наиболее распространённая генетическая причина повышенного уровня ГЦ.

Причины увеличения содержания ГЦ в плазме крови.

1.Генетичские дефекты приводящие к неполноценности ферментов ответственных за метаболизм этой аминокислоты.

2. Недостаток поступления витаминов-кофакторов ферментов, необходимых для метаболизма ГЦ с пищей или в результате нарушения всасывания в кишечнике.

3. Ряд заболеваний, использование некоторых лекарственных средств.

4. демографические факторы: рост, вес, пол, нация.