2. Исследование системы гемостаза.

В клинической практике исследование системы гемостаза преследует следующие цели:

- диагностика нарушений системы гемостаза;

-выяснение допустимости оперативного вмешательства при выявленных нарушениях в системе гемостаза;

-проведение контроля за лечением антикоагулянтами прямого и непрямого действия, а также тромболитической терапией.

• Лабораторные тесты:

• измерение числа и функции тромбоцитов (адгезия, агрегация) путем микроскопии или с использованием гематологических анализаторов (при скрининговых исследованиях) и агрегометров;

• функциональные коагуляционные, или так называемые клоттинговые (по оценке времени свертывания мануально или с использованием коагулометров разных конструкций);

• определение параметров фибринолиза;

• амидолитические (тесты с использованием хромогенных субстратов к тромбину, плазмину, фактору Xа, XIIIа и др., и фотометров с фиксированной длиной волны измерений);

• иммунологические методы, позволяющие выявить уровень искомого антигена или антител при антифосфолипидном синдроме и др.

2.1.Тесты для оценки сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

Первичный гемостаз нарушается при изменениях сосудистой стенки (дистрофические, иммуноаллергические, неопластические и травматические капилляропатии); тромбоцитопении; тромбоцитопатии, сочетание капилляропатий и тромбоцитопений.

• Клинико-функциональные пробы при исследовании сосудисто-тромбоцитарного гемостаза:

• определение ломкости микрососудов с помощью пробы щипка, пробы жгута- манжеточной компрессии (проба Кончаловского-Румпель-Лееде);

• определение времени капиллярного кровотечения без дополнительной компрессии (проба Дьюка с проколом уха и др.) – от 2 до 4,5 мин., либо на фоне венозного стаза (сдавление плеча манжетой до 40 мм.рт.ст. с проколами или надрезами кожи предплечья) – проба Айви – до 9 мин.

Время кровотечения - это время от момента нанесения стандартной раны кожи до момента прекращения вытекания крови. Оно характеризует функциональную активность тромбоцитов и взаимодействие тромбоцитов с сосудистой стенкой. Время кровотечения не выявляет всех тромбоцитарных нарушений (такого метода вообще не существует), этот скрининговый тест позволяет заподозрить тромбоцитопатии различного генеза, болезнь фон Виллебранда и нарушения проагрегантных свойств сосудистой стенки. После выявления патологии, нет необходимости повторять это исследование, а нужно использовать более чувствительные и специфические методы.

Количество тромбоцитов в крови

Референтные значения: 180-320x10⁹/л.

Индуцированная агрегация тромбоцитов

Методы определения агрегации тромбоцитов:

• с АДФ

• с адреналином

• с коллагеном

• с арахидоновой кислотой

• с тромбином

• с ристомицином (ристоцетином)

2.2. Скрининговые тесты для оценки плазменного звена гемостаза:

Коагулогический анализ играет важную роль при подтверждении диагноза коагулопатии и при дифференцировании разных коагулопатий. Он предусматривает определение времени свёртывания крови по Ли-Уайту или времени рекальцификации, причём эти тесты проводят in vitro (для исключения влияния сосудистых механизмов). Но многие современные лаборатории отказались от них, так как они по своей диагностической ценности уступают АПТВ и протромбиновому времени.

• АПТВ (активированное парциальное тромбопластиновое время)

• протромбиновое время (по Квику)

• тромбиновое время

• определение количества фибриногена

Основным тестом на состояние внутреннего пути свертывания плазмы является АПТВ, на состояние внешнего пути - протромбиновое время.

• Активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АПТВ).

АПТВ используется как скрининговый тест для оценки внутреннего пути коагуляции, диагностики волчаночного антикоагулянта и слежения за антикоагулянтным действием гепаринов. Параметр АПТВ характеризует скорость внутреннего каскада (факторы XII-VIII, V, II, I), при дефиците этих факторов, а также прекалликреина и высокомолекулярного кининогена АПТВ удлиняется. АПТВ – более значимый тест для выявления врождённых коагулопатий, чем протромбиновое время, так как выявляет относительно часто встречающуюся гемофилию А и В (дефицит факторов VIII и IX соответственно).

Референтные значения АПТВ: 25-35 с

• Протромбиновое время (тест Квика).

Протромбиновое время (ПВ) – широко используемый скрининговый тест для оценки внешнего каскада свертывания плазмы. Он отражает скорость работы внешнего пути и общего пути коагуляции (факторы VII, X, V, II,I). В нём не учитывается состояние внутреннего пути свёртывания и не требуется контактной активации фибринообразования. ПВ обычно используется для определения активности ф.VII, контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами, при скрининге системы гемостаза, а также для количественного определения фибриногена в автоматических коагулометрах. Референтные значения ПВ: 11-15 с

Результаты определения протромбинового времени могут быть представлены в различной форме (табл.3).

Первые три выражения, хотя и представляются в виде цифр, но из-за отсутствия калибровки являются, по сути, качественными показателями с неопределенным масштабом. Кроме того, существенным недостатком определения протромбинового времени в секундах является низкая воспроизводимость из-за нестандартизированного тромбопластина.

Таблица 3.

Формы выражения протромбинового времени

Показатель	Расчёт	Примечание	Корреляция
Протромбиновое время (ПВ), сек	Время свёртывания плазмы после добавления тромбопластин-кальциевой смеси.	Не позволяет проводить сравнительную оценку результатов в связи с применением тромбопластинов различного МИЧ (cм. МНО)
Протромбиновый индекс (ПТИ), %	ПВ нормальной контрольной плазмы (или среднее ПВ нормального диапазона)/ПВ плазмы больного)х100%	Результаты теста зависят от чувствительности используемого тромбопластина.	Отрицательная – с протромбиновым отношением и МНО
Протромбиновое отношение (ПО), %	ПВ плазмы больного/ПВ нормальной контрольной плазмы (или среднее ПВ нормального диапазона)х100%	Результаты теста зависят от чувствительности используемого тромбопластина.	Положительная – с МНО, отрицательная – с протромбиновым индексом
Протромбин по Квику (%)	Аналогично ПТИ, но расчёт производится в зависимости от концентрации факторов протромбинового комплекса	Результаты теста зависят от чувствительности используемого тромбопластина.	Отрицательная – с ПО и МНО, совпадает с ПТИ в области нормальных значений
Протромбиновое время, выраженное через МНО - международное нормализованное отношение, латинская аббревиатура INR (International Normalized Ratio).	(ПВ плазмы больного/ПВ нормальной контрольной плазмы (или среднее ПВ нормального диапазона) х МИЧ.	ISI (МИЧ) - (international sensitivity index - международный индекс чувствительности) – показатель чувствительности тромбопластина относительно международного стандарта (указывается в паспорте набора), что позволяет сравнивать между собой результаты, полученные с применением тромбопластина различной чувствительности.

Поэтому нельзя сопоставлять результаты у одного пациента, полученные в разных лабораториях, на разных приборах или с тест-наборами разных серий. Выражение ПТИ в процентах (условная норма 70-120%) не имеет смысловой нагрузки и путает врачей, так как между количеством факторов свёртывания и измерением ПВ в секундах нет прямой пропорциональной зависимости.

Протромбин по Квику и протромбиновое время, выраженное через МНО для ПВ являются взаимодополняющими.

Протромбин по Квику как и протромбиновый индекс (%), позволяет определять активность протромбинового комплекса плазмы пациента в сравнении с измеренным протромбиновым временем контрольной плазмы. Но при этом расчет протромбинового времени проводится в зависимости от % содержания факторов протромбинового комплекса, по кривой построенной с использованием разных разведений контрольной плазмы. Такой способ представления результатов является более точным, особенно в области низких значений. Протромбиновый индекс и протромбин по Квику могут совпадать друг с другом в области нормальных значений. В зоне значений, рекомендованных для ведения больных, принимающих непрямые антикоагулянты, показатели этих тестов расходятся. Протромбиновый индекс 50-60% может соответствовать 30-40% протромбина по Квику. Расчет протромбина по Квику в настоящее время является общепринятым способом.

МНО (Международное нормализованное отношение), латинская аббревиатура INR (International Normalized Ratio) - дополнительный способ представления результатов протромбинового теста, рекомендованный для контроля терапии непрямыми антикоагулянтами комитетом экспертов ВОЗ, Международным комитетом по стандартизации в гематологии.

МНО рассчитывается по формуле:

МНО=(ПТВ больного / ПТВ стандартной плазмы здоровых людей) Х МИЧ, где МИЧ – международный индекс чувствительности (указывает производитель реактивов), соотносит активность тканевого тромбопластина из животных источников со стандартом человеческого тканевого тромбопластина. МИЧ=ISI (International Sensitivity Index of thromboplastin). МНО - математическая коррекция, при помощи которой производится стандартизация протромбинового времени, что позволяет сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях. Норма МНО- 0,8-1,3. МНО и протромбин по Квику коррелируют отрицательно - снижение протромбина по Квику соответствует повышению МНО. Удлинение протромбинового времени (ПТИ снижается, МНО увеличивается): наклонность к гипокоагуляции. Основные причины:

нарушение белок-синтетической функции печени дефицит витамина К (обычно при нарушении расщепления и всасывания жиров в кишечнике) лечение антикоагулянтами непрямого действия дефицит факторов II, V, VII, X.

• Тромбиновое время.

Тромбиновое время (ТВ) – определение тромбинового времени является третьим по значимости базисным скрининговым тестом. Тест характеризует конечный этап процесса свертывания – превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина. На него влияет концентрация фибриногена в плазме и активность ингибиторов тромбина (АТIII, гепарин, парапротеины, продукты распада фибриногена и фибрина). Оценивает как III фазу свертывания крови, так и состояние естественных и патологических антикоагулянтов. Удлиняется тромбиновое время при а- и гипофибриногенемиях (тяжёлые поражения печени, фибринолиз, острый ДВС-синдром), терапии гепарином

Референтные значения ТВ: 12-16 с.

• Концентрация фибриногена в плазме.

Количество фибриногена в крови можно определить весовым методом по Рутберг. Снижение концентрации (уменьшение ниже 0,5-1 г/л вызывает кровоточивость) врожденные афибриногенемии, гипо- и дисфибриногенемии

тяжелые поражения печени состояние после кровотечения, травмы, ожога.

Референтные значения фибриногена: 2-4 г/л.

• Оценка ретракции кровяного сгустка – трудно стандартизируемый тест. Ретракция нарушается при заметном снижении количества тромбоцитов или при дефектности их цитоскелета и энергетического обмена, а также при выраженном снижении количества фибриногена в плазме.

2.3Тесты для оценки антикоагуляционных факторов.

Используются для выявления гиперкоагуляции у лиц с тромбофилическим синдромом.

• Протеин С

Для определения протеина С разработано несколько методов: иммунохимический метод, метод с хромогенным субстратом и коагуляционный. Протеин С только в комплексе с протеином S инактивирует Vа и VIII, поэтому желательно параллельно исследовать и протеин С и протеин S.

Референтные значения протеина С: 70-130%

• Протеин S

Протеин S – витамин-К-зависимый белок, который является кофактором активированного протеина С. Это функция положена в основу всех известных коммерческих тест-систем определения протеина S. Описаны случаи как функционального, так и количественного дефицита протеина S. При проведении тестов важно помнить, что протеин S присутствует в плазме частично в свободном состоянии, частично в комплексе с С4-связывающим протеином (С4-СП), но активна только свободная форма протеина S.

Референтные значения протеина S свободного: 65-144%

• Антитромбин III

Для определения активности антитромбина III (АТ) чаще всего используют метод с хромогенным субстратом. Антитромбин расщепляет субстрат, в результате чего образуется окрашенный продукт, количество которого зависит от исходной активности антитромбина III. Снижение антитромбина III – фактор риска тромбозов, а повышение расценивают как фактор риска кровотечений.

Референтные значения АТ III: 80 - 120%

• Определение анти Ха активности гепарина в плазме крови оптическим методом.

Гепарин, кислый мукоплисахарид, вырабатываемый тучными клетками, гепарин является естественным противосвертывающим фактором. Относится к антикоагулянтам прямого действия, т.е. влияющим непосредственно на факторы свертывания (XII, X, IX, VII, II). Гепарин применяют для профилактики и терапии различных тромбоэмболических заболеваний и их осложнений. При проведении гепаринотерапии необходим лабораторный контроль содержания гепарина в плазме крови пациента. Основным ингибитором тромбина, активированного фактора Xa и других сериновых протеаз коагуляционного каскада является антитромбин III (ATIII). В нормальных условиях скорость ингибирования мала, но она возрастает в несколько тысяч раз в присутствии гепарина. Этот механизм объясняет антикоагулянтное действие гепарина. Препараты низкомолекулярного гепарина в комплексе с АТIII ингибируют действие активированного фактора Xа в гораздо большей степени, чем тромбина. По этой причине тест ингибирования активности фактора Xa является наиболее чувствительным и информативным из всех способов определения активности гепарина в плазме крови.

Метод определения активности гепарина основан на способности комплекса АТIII-гепарин нейтрализовать активированный фактор Ха. Активность гепарина определяют в плазме, добавляя к ней избыток антитромбина III и фактора Xa. При этом происходит ингибирование фактора Xa комплексом АТIII-гепарин пропорционально количеству гепарина в плазме. Интерпретация результатов.

Терапевтическая область 0,3-0,7 ед/мл анти- Xa активность.

Профилактическая область 0,1-0,3 ед/мл анти- Xa активность.