1. Выделение чистой культуры аэробов и ее идентификация.

Получение чистой культуры микроорганизмов происходит в несколько этапов: сначала производят механическое разобщение для посева исследуемого материала на питательную среду. При посеве необходимо получить рост отдельных колоний. При выделении культуры бактерий из зева посев производят тампоном, втирая материал в питательную среду (ЖСА).

В этом конкретном случае для выделения чистой культуры стафилококка используют разобщение микробов и применение элективной питательной среды – желточно-солевого агара Чистовича, на котором вырастают в основном только колонии стафилококков.

Изучают рост колоний (второй день исследования) и делают высев на скошенный МПА. Колония – это потомство одной микробной клетки. У каждого вида бактерий колонии обладают характерными признаками. Учитывают размеры колоний, их число, форму, характер края, поверхность, структуру, прозрачность, наличие пигмента, выделение фермента патогенности – лецитовителлазы (расщепление лецитина питательной среды до диглицерида, который дает образование ореола вокруг колоний). Например, колонии патогенного стафилококка могут быть круглые выпуклые, с ровным краем, гладкой поверхностью, имеют золотисто-желтый пигмент, выделяют лецитовителлазу.

Для идентификации культуры применяют методы: изучение морфологии при окраске по Грамму; определение биохимических свойств бактерий (спектр расщепления углеводов по средам Гисса); выявление образования ферментов патогенности, токсинов и антигенной структуры по реакциям со специфической иммунной сывороткой; определение чувствительности культуры к антибиотикам.

2. Методы культивирования анаэробов.

По характеру биологического окисления и получению энергии все микроорганизмы подразделяют:

- Строгие аэробы (растут в присутствии кислорода)

- Микроаэрофилы (растут при малом содержании кислорода).

- Факультативные анаэробы (могут расти при аэробных и анаэробных условиях).

- Строгие анаэробы (кислород для них не является конечным акцептором электронов и может оказывать угнетающее действие на их рост). Ферментация глюкозы в анаэробных условиях дает значительно меньше энергии, чем при расщеплении ее аэробами.

Питательные среды, применяемые для культивирования анаэробов - тиогликолевая жидкая питательная среда, 10 % молоко по Тукаеву, сахарный агар и сахарный бульон (высоким столбиком), среда Китта-Тароцци, (содержит глюкозу, кусочки паренхиматозной ткани, сверху залита вазелиновым маслом).

Среда Вильсона-Блера (МПА, содержит хлорное железо и сульфит натрия), при росте анаэробов образуется сернистое железо, колонии окрашиваются в черный цвет.

В этих средах достигается создание анаэробных условий, однако, для выделения чистой культуры и идентификации микробов необходимо помещать чашки и пробирки с посевами в особые условия, при отсутствии кислорода, для чего применяют биологический, физический и химический методы.

Биологический метод Фортнера. На чашку с питательной средой (кровяной агар с глюкозой) делают посев; на одну половину - аэробной культуры, на другую – анаэробов; крышку чашки парафинируют и ставят в термостат. Сначала растут аэробы, поглощающие кислород, затем – анаэробы

Физический метод: применение анаэростата (герметически закрытый металлический прибор с манометром), из которого откачивается воздух или заменяется индифферентным газом.

Возможно использование химических веществ, поглощающих кислород в герметически закрытых приборах.

Так как большинство патогенных анаэробов относится к роду Clostridium, и образуют споры, перед посевом материал прогревают для уничтожения других бактерий.

Для получения чистой культуры анаэробов сначала делают посев материала на тиогликолевую среду, и затем высев по Цейсслеру на чашки с сахарно-кровяным агаром, которые культивируют в анаэробных условиях, или рассев по Вейнбергу в высоких столбиках расплавленного сахарного агара. При росте колоний делают распил на нужном уровне и высев из одной колонии на тиогликолевую среду.

Тесты для рейтингового контроля.

1.Для идентификации чистой культуры бактерий используют:

1). простой метод окраски препаратов.

2). характеристику колоний.

3). окраску по Граму.

4). определение размеров бактерий.

2.Для создания анаэробных условий культивирования используют:

1). посев на чашки с МПА.

2). биологический метод Фортнера.

3). применение бактериофага.

4). тиогликолевую среду.

5). анаэростат.

3.По типу дыхания микроорганизмы могут быть:

1). гетеротрофы.

2). аэробы.

3). имеющие капсулу.

4). анаэробы.

Самостоятельная работа студентов.

1.Просмотреть чашки с посевом материала из зева для выделения стафилококка.

Сделать описание характера выросших колоний: число колоний, размер, форма, край, поверхность, наличие пигмента, лецитовителлазы (ореол вокруг колонии).

Сделать мазок из колонии, окрасить по Граму, зарисовать.

Для выделения чистой культуры из одной колонии произвести высев на скошенный МПА.

2.Просмотреть демонстрационный препарат анаэробов в посеве почвы на тиогликолевую среду. Обратить внимание на наличие в препарате Грам-положительных палочек.

3.Записать в протокол среды для культивирования, способы создания анаэробных условий культивирования и методы выделения чистых культур анаэробов.