2. Сложные методы окраски.

На препарат последовательно наносят красители различные по химическому составу и цвету, что позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать микроорганизмы.

Метод Грамма разработан датским ученым Х. Грамом в 1884 году. Он позволяет выявить структуры клеточных стенок и химические особенности бактерий. Грамположительно в фиолетовый цвет окрашиваются бактерии, у которых клеточная стенка содержит много слоев пептидогликана, соединенного поперечными мостиками в плотный чехол. Кроме того, в цитоплазме содержатся магниевые соли РНК, изоэлектрическая точка рН 2-3. Комплекс генцианвиолета и йода у этих бактерий образует химическое соединение с магниевыми солями рибонуклеиновой кислоты, которое не разрушается спиртом и не проходит через плотную клеточную стенку, поэтому цитоплазма бактерий окрашивается в фиолетовый цвет. Примеры грамположительных бактерий - стафилококки, стрептококки, микобактерии, возбудитель дифтерии и др. У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом обесцвечивается этанолом и легко выходит через клеточную стенку, имеющую тонкий слой пептидогликана, покрытого наружной плазматической мембраной, которая содержит липополисахариды и липопротеиды. Белки внешней мембраны являются поринами, через которые могут проникать гидрофильные молекулы величиной до 6000 Да, поэтому грамотрицательные бактерии не окрашиваются генцианвиолетом, а воспринимают дополнительную окраску фуксином. Например: менингококки, гонококки, кишечная палочка, холерный вибрион и др.

Техника окраски

1. Препарат залить генцианвиолетом – 3-4 мин.

2. затем раствором люголя – 2 мин.

3. обесцветить спиртом – 15-20 сек.

4. Промыть водой.

5. докрасить фуксином водным 2-3 мин.

6. Смыть краску водой, препарат просушить фильтровальной бумагой.

Метод Бурри-Гинса применяется для обнаружения капсул.

Капсулы представляют собой наружный слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов или пептидов с содержанием большого количества воды, поэтому капсула не окрашивается анилиновыми красителями. Для выявления капсулы по методу Бурри-Гинса культуру бактерий смешивают на предметном стекле с тушью, мазок высушивают, фиксируют и докрашивают обычным фуксином. При этом на черном фоне капсулы видны светлыми ореолами вокруг розовых бактерий. Например: пневмококки, возбудитель чумы, сибирской язвы и др.

Техника приготовления препарата.

На предметное стекло наносят каплю культуры и каплю туши, смешивают их краем шлифованного предметного стекла и делают препарат по типу мазка крови, затем высушивают, фиксируют и докрашивают две минуты водным фуксином.

Метод Циля-Нильсена применяется для выявления бактерий и спор, обладающих кислотоустойчивостью. Кислотоустойчивые микроорганизмы не окрашиваются простыми методами, так как содержат в клеточной стенке до 40% жировосковых веществ и фосфолипидов. Поэтому препараты сначала протравливают кислотой (метод Ожешка) и окрашивают при подогревании краски основным карболовым фуксином Циля (метод Циля-Нильсена). Затем препарат обесцвечивают серной кислотой и докрашивают метиленовой синькой. При этом кислотоустойчивые бактерии и споры окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые элементы и бактерии - в синий.

Техника окраски.

1. На фиксированный препарат нанести раствор основного фуксина через кусочек фильтровальной бумаги, подогреть краску до появления пара 3-5 мин.

2. Снять фильтровальную бумажку, нанести 3-5% раствор серной кислоты - 20-30 сек. и смыть водой.

3. Докрасить препарат водной метиленовой синькой – 3-5 мин.

тесты для рейтингового контроля (примеры).

1. Клеточная стенка у грамположительных бактерий имеет:

1. много слоев пептидогликана.

2. наружную плазматическую мембрану.

3. в основном полисахариды.

2. Грамположительные бактерии - это:

1. менингококки.

2. стрептококки

3. стафилококки

4. кишечная палочка.

5. микобактерии туберкулеза.

3. Для выявления капсулы применяют методы окраски:

1. по Граму.

2. по Цилю-Нильсену.

3. простую окраску фуксином.

4. метод Бурри-Гинса.

Самостоятельная лабораторная работа студентов.

1. Приготовление мазка из смеси E.Coli и Staphylococus albus.

Окраска по Граму. Записать процесс окраски грамположительных и грамотрицательных бактерий.

2. Определение подвижности E.Coli.

3. Просмотреть демонстрационные препараты:

а) споры В.anthraсoides, окрашенные по методу Циля-Нильсена

б) капсулы В.Friedlanderi, выявленные по Бурри-Гинсу

в) препарат Neisseriae gonorrhoeae грамотрицательный.

Г) препарат Corynebacterium diphtheriae грамположительный.

4. Зарисовать все препараты цветными карандашами, указать латинские названия микробов

5. Получить подпись преподавателя под протоколом.