Кредит № 4

1. Лекция 1. Инструментальные методы анализа. Классификация ИМА.

2. Цель лекции: Дать понятие об инструментальных методах анализа. Рассмотреть понятия правильности и воспроизводимости ИМА.

3. Тезисы лекции: Физические и физико-химические методы анализа основаны на ис­пользовании зависимости между измеряемыми физическими свойствами веществ и их качественным и количественным составом. Эти методы анализа называют также инструменталь­ными методами.

Классификация физических и физико-химических методов анализа основана на учете измеряемых физических и физико-химических свойств вещества или изучаемой системы.

Оптические методы основаны на измерении оптических свойств веществ.

Хроматографические методы основаны на использовании способ­ности различных веществ к избирательной сорбции.

Электрохимические методы основаны на измерении электрохими­ческих свойств систем.

Радиометрические методы основаны на измерении радиоактивных свойств веществ.

Термические методы основаны на измерении тепловых эффектов соответствующих процессов.

Масс-спектрометрические методы основаны на изучении ионизи­рованных фрагментов («осколков») веществ.

Применяются также и другие методы анализа (ультразвуковые, магнитохимические, пикнометрические и др.).

Чувствительность метода определяется двумя факторами: интенсивностью измеряемого физического свойства и чувствительностью детекторов сигнала в приборе для инструментального анализа.

Фотометрические методы обладают чувствительностью от 10^-6 г, а радиометрические − до 1· 10^-15 г. Высокая чvвствительность многих методов объясняется свойствами применяемых детекторов сигнала в приборах. Электрохимические методы имеют высокую чувствительность благодаря применению высокочувствительных регистраторов тока и потенциала.

Важным преимуществом многих инструментальных методов яв­ляется их высокая избирательность − селективность. Ряд инструментальных методов, (рефрактометрия, интерферометрия) - неселективны и используются в тех случаях, когда анализируются либо индивидуальные вещества, либо несложные смеси. Высокая степень селективности присуща методам, основан­ным на характерных свойствах молекул, функциональных группировок, атомов, обладающих эмиссионными и абсорбционными спектрами, радиоактивностью, способностью к электрохимическому восстановлению или окислению

Правильность инструментальных методов анализа зави­сит от того, насколько свойство адекватно отражает состав и свя­зано с ним строго определенными закономерностями. Закономерно­сти, связывающие свойство и состав, устанавливают экспериментально. Поэтому при проведении инструментального анализа предварительно проводят калибровку аналитических приборов и выявление зависимости физического свойства от состава. Эти задачи решаются с помощью стандартных образцов.

Для получения точных результатов на приборе производят обычно не менее 3-5 измерений образца, затем их обрабатывают методами математической статистики. Точность инструментальных методов сильно колеблется в зависимости от метода (от 0,001 % до 0,1 %).

В инструментальном анализе применяют несколько методов определения концентраций веществ. В общем виде их можно разделить на две группы использованием стандартов веществ и с применением аналитических факторов (показателей) веществ. Стандарты используют в следующих методах аналитических определений.

Метод калибровочного графика. Готовят серию разведений стандартного раствора вещества с известной концентрацией, замеряют на приборе характеристику свойства приготовленных растворов. По полученным данным строят калибровочный график. Затем измеряют характеристику анализируемого раствора и по графику определяют его концентрацию.

Метод сравнения (метод стандарта). Используется в тех случаях, когда линия зависимости состав − свойство имеет прямолинейный характер и проходит через начало осей координат. На приборе замеряют характеристики свойств стандартного и анализируемого растворов. При этом отношение концентраций стандартного и анализируемого растворов равно отношению характеристик:

С_с /С_х =f_c/f_x (1.1)

Метод сравнения обладает меньшей точностью, чем метод калибровочного графика (используется только одно измерение стандарта).

Метод добавок. Замеряют сначала свойство анализируемого paствopa, затем повторяют измерение, добавив к раствору определенное количество стандарта. Если зависимость состав ­ свойство прямолинейна, то приращение концентрации анализиру­емого раствора С_с вызывает соответствующее приращение характеристики свойств fc и можно записать равенства:

(С_х + С_с) / С_с = (f_x + f_c) / f_c (1.2)

Откуда С_х = С_с f_x / f_c (1.3)

Метод аналитических факторов (показателей). Этот метод основан на использовании численных значений свойства, отвечающих еди­нице концентрации вещества. Аналитические факторы употребляют в расчетах при строгом соблюдении определенных закономерностей, связывающих характеристику свойства вещества с его концентрацией в растворе. Применяют два вида аналитических факторов: молярные показатели F_м - соответствующие молярной концентрации вещества (моль/дм³); удельные показатели F_% - соответствующие процентной концентрации вещества. Расчет концентраций при использовании аналитических факторов значительно упрощается. Измеряют свойство раствора и делят его на фактор. При этом получают концентрацию вещества в растворе в соответствующих единицах:

С = f / F (моль/дм³); С = а / F (в %). (1.4)

Кривые инструментального титрования строят в координатах: свойство титруемого раствора − объем добавленного титранта. В точке эквивалентности на кривой титрования наблюдается перелом. В общем случае различают интегральные кривые − на графике откладывается значение свойства и дифференциальные − на графике откладывается разностное значение свойства (разность между двумя последовательными измерениями свойства).

4. Иллюстративный материал:

Табл.1

Рис.1. Калибровочный график фотометрического определения

5. Литература:

Основная: 1, 2, 3, 4, 5.

Дополнительная: 7, 8.

6. Контрольные вопросы:

• Понятие об инструментальных методах анализа.

• Классификация ИМА.

• Чувствительность, воспроизводимость и правильность ИМА.

• Основные блоки аналитических приборов.

• Методы проведения количественных измерений в ИМА.

1. Лекция 2. Оптические методы анализа. Закон Бугера-Ламберта-Бера.

2. Цель лекции: Изучить оптические методы анализа и их классификацию. Рассмотреть методы атомно-абсорбционного анализа (фотоколориметрия, спектрофотометрия).

3. Тезисы лекции: Оптические методы анализа основаны на измерении оптических свойств вещества, проявляющихся при взаимодействии элек­тромагнитного излучения с веществом.

Оптические методы анализа классифицируют:

а) По изучаемым объектам на атомный и молекулярный спектральный анализы.

б) По характеру взаимодействия электромагнитного излучения с веществом. Различают следующие методы.

Атомно-абсорбционный анализ основан на измерении поглощения монохроматического излучения атомами определяемого ве­щества в газовой фазе после атомизации вещества.

Эмиссионный спектральный анализ основан на измере­ние интенсивности света, излучаемого веществом при его энергетическом возбуждении.

Пламенная фотометрия основана на использовании газового пла­мени в качестве источника энергетического возбуждения излучения.

Молекулярный абсорбционный анализ. В основе метода лежит изме­рение светопоглощения молекулами или ионами изучаемого вещества. Наиболее распространен.

Люминесцентный анализ основан на измерение интен­сивности излучения люминесценции, т.е. испускания излучения вещест­вом под воздействием различных видов возбуждения.

Спектральный анализ с использованием эффекта комбинационного рассеяния света (раман-эффекта) основан на измерении интенсивности излучения при явлении комбинационного рассеяния света.

Нефелометрический анализ основан на измерении рассеивания све­та частицами света дисперсной системы.

Турбидиметрический анализ основан на измерении ослабления ин­тенсивности излучения при его прохождении через дисперсную среду.

Рефрактометрический анализ основан на измерении показателей светопреломления веществ.

Интерферометрический анализ основан на изучении явления ин­терференции света.

Поляриметрический анализ основан на измерении величины угла вращения плоскости поляризации света опти­чески активными веществами.

Оптический диапазон подразделяют на ультрафиолетовую − УФ (100-380 нм),

видимую − В (380-760 нм) и инфракрасную − ИК (760-10⁵ нм) область спектра.

В основе фотометрических измерений и расчетов лежит закон светопо­глощения, характеризующий зависимость по­глощения монохроматического излучения от толщины поглощающего слоя и от концентрации светопоглощающих частиц. Ос­новной закон светопоглощения или закон Бугера-Ламберта-Бера гласит: интенсивность поглощения света растворами вещества пропорциональна их концентрации С и толщине поглощающего слоя l. Закон можно представить в экспоненциальной форме:

(1.1)

или в логарифмической форме:

(1.2)

Основной закон светопоглощения справедлив только для поглоще­ния монохроматического светового потока с постоянной длиной волны λ = const.

В количественном анализе обычно используется логарифмическая форма (1.2) основного закона светопоглощения, поскольку оптическая плотность А прямо пропорциональна концентрации с.

Величину ε называют молярным коэффициентом (показателем) по- гашения, или молярным коэффициентом (показателем) экстинкции. Кроме оптической плотности А используют также пропускание, или светопропускание:

(1.3)

которое связано с оптической плотностью А следующим образом:

(1.4)

A = 2- lg T (1.5)

Рабочий интервал измене­ния оптической плотности, приемлемый для аналитических фотомет­рических измерений, составляет 0,2-0,8 единиц, оптимальный − 0,2-0,6 единиц; наименьшую ошибку получают при значении оптической плот­ности 0,434.

Фотоколориметрия. Метод основан на измерении интенсивности немонохроматического светового потока, прошедшего через анализируе­мый раствор, с помощью фотоэлементов в фотоколориметрах и в фото-электроколориметрах. Световой поток от источника излучения (лампы накаливания) проходит через светофильтр, пропускающий излу­чение лишь в определенном интервале длин волн, затем через кювету с анали­зируемым раствором и попадает на фотоэлемент, преобразующий свето­вую энергию в фототок, регистрируемый соответствующим прибором. Чем больше светопоглощение анализируемого раствора (т.е. чем выше его оптическая плотность), тем меньше энергия светового потока, попа­дающего на фотоэлемент.

Разработаны различные конструкции фотоэлектроколориметров, предназначенных для работы в ближней УФ и в видимой области спектра. Светофильтры, чаще всего это стекла различного состава и окраски, пропускают излучение шириной в несколько десятков нм (≈ от 20 до 50 нм).

Наиболее распространенными являются фотоэлектроколориметры с одним или с двумя фотоэлементами. Фотоэлектроколориметры с одним фотоэлементом предусматривают измерение энергии однолучевого све­тового потока. Приборы с двумя фотоэлементами измеряют энергию двух световых потоков, один из которых проходит через анализируемый раствор, а другой − через раствор сравнения («ну­левой» раствор).

Концентрацию определяемого вещества в анализируемом растворе находят либо с использованием основного закона светопоглощения, либо методом градуировочного графика. Относительная ошибка фото-колориметрического определения кон­центрации обычно не превышает ± 3%.

Метод обладает сравнительно высокой чувствительностью и хоро­шей воспроизводимостью, селективностью, прост по выполнению изме­рений оптической плотности или пропускания, использует относительно несложную аппаратуру. Однако немонохроматичность регистрируемого светового потока несколько понижает точность и воспроизводимость аналитических измерений.

Спектрофотометрия. Этот метод основан на использовании спектрофотометров, позволяющих регистрировать световые потоки в широком интервале изменения длин волн (от 185 нм до 1100 нм) и обеспечивающих высо­кую степень монохроматичности света (0,2-5 нм), проходящего через анализируемую среду. В большинстве спектрофотометров монохроматизация светового потока осуществляется за счет использования диспергирующих элементов − призм или дифракционных решеток. В качестве источника излучения в спектрофотометрах используют лампы накаливания и водородные либо дейтериевые лампы.

Разработаны различные приемы спектрофотометрии − прямая, дифференциальная, производная спектрофотометрия, спектрофотометрическое титрование.

Концентрацию определяемого вещества в анализируемом растворе при спектрофотометрических измерениях находят с использованием либо основного закона светопоглощения, либо градуировочных графиков.

Спектрофотометрические методы обладают, по сравнению с фото-электроколориметрическими, большей точностью и чувствительностью, позволяют проводить анализ многокомпонентных систем без разделения компонентов, определять вещества, не поглощающие в видимой области спектра (но имеющие полосы поглощения в УФ диапазоне). Относитель­ные ошибки спектрофотометрических определений не превышают ±2%.

В отличие от фотоколориметрии и фотоэлектроколориметрии, спек­трофотометрия позволяет получать спектры по­глощения в широком спектральном диапазоне.

4. Иллюстративный материал:

Табл.1 Основные цвета видимого спектра

Рис.1. Зависимости пропускания и оптической плотности от толщины поглощающего слоя l и концентрации раствора С.

5. Литература:

Основная: 1, 2, 3, 4, 5.

Дополнительная: 7, 8.

6. Контрольные вопросы:

• Оптические методы анализа. Классификация и сущность методов.

• Атомно-абсорбционный анализ.

• Фотоколориметрия. Основной закон светопоглощения.

• Спектрофотометрия.

• Примеры практического применения методов.

1. Лекция 3. Хроматографические методы анализа.

2. Цель лекции: Изучить инструментальные хроматографические методы анализа. Рассмотреть методы ЖХ и ГЖХ.

3. Тезисы лекции: Газовая хроматография − процесс разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении компонентов между двумя фазами − газом-носителем и либо твердой фазой, либо жидкостью, нанесенной в виде тонкой пленки на поверх­ность твердого носителя или стенки хроматографической колонки. В первом случае метод называется газоадсорбционной хроматографией, во втором − газожид­костной (распределительной) хроматографией. Наиболее распространенной является распределительная га­зожидкостная хроматография − ГЖХ.

Сущность метода ГЖХ состоит в следующем. Анализируемая смесь летучих компонентов переводится в парообразное состояние и смешивается с потоком инертного газа-носителя, образуя с ним подвижную фазу. Эта смесь попадает в хроматографическую колонку, заполненную неподвижной (стационарной) жидкой фа­зой.

Поскольку сродство различных разделяемых веществ к НФ различно, то в процессе сорбционных − десорбционных переходов они задерживаются в НФ неодинаковое время. Пары разделенных компонентов вместе с газом-носителем поступа­ют в детектор хроматографа, генерирующий электрический сигнал. Электрический сигнал усиливается и фиксируется регистратором хрома­тографа в виде хроматограммы, записываемой на диаграммной ленте или на мониторе компьютера. Эти хроматограммы и используются для качественной и количественной об­работки результатов анализа разделяемой смеси компонентов

Хроматограмма − это зарегистрирован­ная во времени последовательность показаний регистратора. Каждому разделенному компоненту смеси соответствует свой пик на хроматограмме. По оси абсцисс откладывается время (или расстояние), по оси ординат − величина аналитического сигнала.

Время удерживания − качественная характеристика каждого ком­понента; измеряется от момента ввода пробы до момента выхода макси­мума (вершины) пика. Оно зависит от природы хроматографируемого вещества и газа-носителя, скорости прохождения ПФ через хроматографическую колонку, от природы и массы НФ, температуры, длины колон­ки. Чем выше коэффициент распределения хроматографируемого вещества, тем больше и его время удерживания.

Хроматографирование проводят на газовых (газожидкостных) хро­матографах различной конструкции. На рис.1показана принципиаль­ная блок-схема газового хроматографа.

Идентификация разделяемых компонентов проводится преиму­щественно двумя методами: с использованием веществ-свидетелей и времени удерживания.

Для расчета содержания опреде­ляемых компонентов в хроматографируемых смесях приме­няют следующие методы: абсолютной гра­дуировки (калибровки), внутренней нормализации и внутреннего стан­дарта. Все методы основаны на измерении параметров пиков на хроматограмме: их площади или высоты. Чаще измеряют площади пиков. Использование площадей пиков при количественном определении содержания компонентов смеси основано на существовании прямой про­порциональной зависимости между площадью пика данного компонента смеси и его содержанием в хроматографируемой пробе:

(1.1)

где S- площадь пика на хроматограмме, т - масса данного компонента в пробе, к - коэффициент пропорциональности.

Площади пиков на хроматограмме измеряют интегратором хромато­графа. Это − наиболее точный метод; ошибка измерения площади пика − меньше 1%. При отсутствии интегратора площадь пиков рассчитывают, измеряя их высоту и ширину или полуширину. В этом случае погрешно­сти определения площади пиков достигают нескольких процентов.

Методы ГЖХ используются для разделения различных смесей, в том числе оптических изомеров, идентификации веществ, их количественно­го определения. В фармакопейном анализе ГЖХ используют при контроле качества субстанций и лекарственных форм, чаще всего для идентификации и определения остаточных летучих растворителей, следы которых сохра­няются в препаратах при их получении. Методами высокоэффективной капиллярной ГЖХ определяют ме­таболические профили биологических сред − крови, мочи, слюны.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), или жидкостная хроматография высокого давления, основана на тех же принципах, что и ГЖХ, только вместо газа-носителя в качестве ПФ применяется поток жидкости, не смешивающейся с жидкой НФ хроматографической колон­ки. Разделение компонен­тов основано на различии их ко­эффициентов распределения меж­ду НФ и ПФ.

ВЭЖХ очень широко применяется для идентификации, разделения и определения самых различных веществ: оптически активных соединений белков, нуклеиновых и аминокислот, полисахаридов, красителей, взрыв­чатых веществ, биологических сред, лекарственных препаратов и т.д.

При технологическом и фармакопейном контроле качества лекарст­венных субстанций и лекарственных форм ВЭЖХ стала одним из основ­ных методов определения как самих фармакологически активных ве­ществ, так и вспомогательных компонентов и посторонних примесей. Так, например, методом ВЭЖХ анализируют лекарственные препа­раты амизол, вальпроат натрия, глиборал, диклофенак натрия, козаар, кофеин, лидокаина гидрохлорид, параце­тамол, пилокарпина гидрохлорид, пирацетам, соталола и цетилпиридина гидрохлориды, флуконазол и др.