Заняття 1 мікроскоп. Мікроскопічне обладнання. Гістологічна техніка

Актуальність теми: Основними методами вивчення біологічних мікрооб'єктів є світлова і електронна мікроскопія, які широко використовуються в експериментальній і клінічній практиці. У практичній діяльності лікаря мікроскоп необхідний для правильної діагностики захворювань, подальшого їх лікування і профілактики.

Мета заняття:

ЗНАТИ: Предмет, методи, завдання гістології, методи вивчення живих об'єктів, гістохімічні й інші методи досліджень. Принципи будови і роботи світлового та електронного мікроскопів.

УМІТИ: Приготувати фіксовані гістологічні мікропрепарати. Визначати на електронних мікрофотографіях клітини різної форми, неклітинні структури.

ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ ПОЗААУДИТОРНОЇ ПІДГОТОВКИ ДО ЗАНЯТТЯ

Для реалізації мети навчання необхідні базисні знання-уміння:

1. Визначати основні частини мікроскопа. 2. Визначати оптичну силу лінз. 3. Правила роботи з мікроскопом. 4. Принцип роботи електронного мікроскопа.

Вивчіть тему за конспектом лекції і підручником. Проконтролюйте свої знання за такими питаннями:

1. Визначення гістології. 2. Предмет дослідження цитології і гістології. 3. Основні методи вивчення гістологічних об'єктів. 4. Методи дослідження фіксованих клітин і тканин. 5. Основні етапи виготовлення гістологічного препарату для світлової і електронної мікроскопії. 6. Принципи будови і роботи електронного мікроскопа. 7. Типи електронних мікроскопів. 8. Методи дослідження хімічного складу та метаболізму клітин і тканин.

ОБСЯГ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ НА ЗАНЯТТІ

Гiстологiчними препаратами (мiкропрепаратами) називаються виготовленi з тканин (органiв) забарвленi зрiзи, плiвки, мазки, вiдбитки, окремi клiтини, якi помiстили на предметне скло, залили тонким шаром прозорої речовини i покрили покривним склом. Основними етапами виготовлення гiстологiчного препарату є: отримання матерiалу, його фiксацiя, промивання, зневоднення, ущiльнення, заливка, виготовлення i забарвлення зрiзiв.

Отримання матерiалу. Матерiал - шматочки тканини або органа - гострими ножицями або лезом вирiзається так, щоб уникнути зайвого травмування. Об'єм шматочкiв - приблизно 0.5 - 2.0 см³. Матерiал повинен бути свiжим, тобто брати його треба якнайшвидше пiсля смертi людини або експериментальної тварини.

Фiксацiя матерiалу. Забраний шматочок занурюється у фiксуючу рiдину - фiксатор. Об'єм фiксатора має перевищувати в 50 - 100 разiв об'єм шматочка. Фіксатори бувають простими i складними. Найбiльш поширеним є простий фiксатор - 10% розчин формалiну. Використовується також етиловий i метиловий спирти, розчини солей важких металiв, оцтова, пiкринова, осмiєва кислоти та iншi. Складнi фiксатори - це сумiшi, що складаються з окремих компонентiв у визначених спiввiдношеннях. Наприклад, рiдина Лiллi (96^оспирт, формалiн, льодяна оцтова кислота), рiдина Карнуа (абсолютний спирт, хлороформ, льодяна оцтова кислота) тощо.

Фiксацiю можна проводити при кiмнатнiй температурi, а в разi використання гiстохiмiчних методiв дослiдження - при зниженiй температурi. Термiн фiксацiї залежить вiд властивостей фiксатора, розмiрiв об'єкта - вiд кiлькох хвилин до кiлькох дiб.

Застосування рiзних фiксаторiв обумовлене метою фiксацiї, тобто збереження прижиттєвого стану морфологiчних структур тканини або органа на момент смертi органiзму з найменшими змiнами внаслiдок фiксацiї. Фiксацiя матерiалу полегшує в подальшому сприйняття об'єктами барвникiв i запобiгає процесам гниття.

Промивання матерiалу. Пiсля фiксацiї матерiал звичайно промивається проточною водою протягом 24 - 48 годин для видалення фiксатора.

Зневоднення i ущiльнення матерiалу. Мета цих етапiв - видалення води з шматочкiв i пiдготовка їх до виготовлення тонких зрiзiв.

Зневоднення шматочкiв, якi фiксувалися у водних розчинах, проводиться поступово в спиртах наростаючої концентрацiї: 50^о, 60^о, 70^о, 80^о, 100^о (абсолютний спирт). Останнiй отримують з 96^о спирту шляхом його зневоднення мiдним купоросом або перегонкою через мармурову крошку. Термiн перебування шматочкiв у спиртах рiзної концентрацiї залежить вiд об'єкта i його розмiрiв (вiд кiлькох годин до кiлькох дiб).

Ущiльнення матерiалу досягається просоченням шматочкiв рiдкими середовищами, якi можуть ставати твердими (парафiн, целоїдин). Оскiльки вказанi речовини розчиняються в ксилолi, бензолi або толуолi, то шматочки спочатку занурюють у сумiш спирту з ксилолом (1:1), потiм у двi - три порцiї чистого ксилолу, далi - в сумiш ксилолу з парафiном при 55^оС - 56^оС. Для заливки матерiалу i виготовлення блокiв використовують металевi, паперовi або керамiчнi формочки.

Виготовлення зрiзiв. З парафiнових або iнших блокiв на спецiальному приладi - мiкротомi, можна зробити тонкi (завтовшки 5 - 7 мкм) зрiзи. Для цього користуються мiкротомними ножами. Потiм зрiзи збирають i прикрiплюють до предметного скла, попередньо змазаного сумiшшю бiлка курячого яйця i глiцерину (1:1).

Зрiзи для гiстохiмiчного дослiдження можна зробити на заморожуючому мiкротомi або на мiкротомi-крiостатi. Мiкротом-крiостат - це фреонова холодильна установка, до камери якої вмонтовано мiкротом. Робоча температура в камерi (вiд 0^оС до -20^оС) пiдтримується автоматично. У крiостатi є можливiсть отримати тонкi зрiзи з нефiксованої тканини.

Тонкi зрiзи є прозорими i для того, щоб розрiзнити деталi будови тканини або органа, їх треба забарвити.

Забарвлення зрiзiв. Iснує багато методiв забарвлення зрiзiв, для чого застосовується бiльше трьох тисяч барвникiв. Гiстологiчнi барвники умовно можна роздiлити на загальнi і спецiальнi; за походженням - на рослиннi, твариннi i синтетичнi; за хiмiчними властивостями - на основнi, кислi i нейтральнi.

Загальнi барвники використовуються для вивчення загальної морфологiї клiтин, тканин i органiв. До ядерних барвникiв належать гематоксилiн, кармiн, азур II, сафранiн. Гематоксилiн виготовляють з кори кампешевого дерева, яке росте у Пiвденнiй Америцi. Вiн забарвлює ядра у синьо-фiолетовий колiр. Кармiн - це екстракт яйценосних комах кошенiлi, забарвлює ядра в ясно-червоний колiр. Сафранiн - у темно-червоний, азур II - у фiолетовий колiр. Це основнi катiоннi барвники, якi мiстять позитивно зарядженi атоми азота. Гiстологiчнi структури, що забарвлюються основними барвниками, називаються базофiльними.

Цитоплазматичнi барвники - еозин, еритрозин, кислий фуксин - забарвлюють цитоплазму у рiзнi кольори, найчастiше в рiзнi тони червоного кольору. За хiмiчними властивостями вони є кислими, або анiонними, за походженням - синтетичними. Структури, якi здатнi забарвлюватись кислими барвниками, називаються оксифiльними (ацидофiльними, еозинофiльними).

Нейтральнi барвники - це сумiшi барвникiв, що мiстять кислi і основнi компоненти.

Спецiальнi барвники вибiрково забарвлюють певнi речовини або структури. Наприклад: судан III забарвлює лiпiди в оранжевий колiр, орсеїн - еластичнi волокна в бурий колiр тощо.

Виявити гiстологiчнi структури можна також методом iмпрегнацiї. Це метод обробки шматочкiв або зрiзiв розчинами солей важких металiв з наступним їх вiдновленням.

Процедура забарвлення зрiзiв починається з їх депарафiнiзацiї, тобто обробки ксилолом або толуолом, подальшому проведеннi через спирти все меншої концентрацiї. Далi, згiдно прописiв для кожного методу, зрiзи обробляють у певнiй послiдовностi розчинами барвникiв. Пiсля забарвлення зрiзи зневоднюють у спиртах наростаючої концентрацiї i помiщають у прозоре середовище - канадський бальзам або полiстирол, якi мають показники заломлення, подiбнi до скла.

Гiстологiчнi препарати, виготовленi з дотриманням вищезазначених вимог, можуть зберiгатись дуже довго.

Правила користування мiкроскопом.

1. Мiкроскоп переносять, тримаючи однiєю рукою за колонку, а другою - пiдтримуючи основу.

2. Мiкроскоп розмiщують на робочому мiсцi так, щоб колонка була бiля спостерiгача, а дзеркало було спрямоване до джерела свiтла. Зошит для зарисовки слiд покласти з правої сторони.

3. Перевiрити револьвер мiкроскопа, поставити об'єктив малого збiльшення (8х) i за допомогою макрогвинта наблизити його нижнiй край на вiдстань 1 см вiд предметного столика.

4. Встановити освiтлення, повертаючи дзеркало до такого положення, коли усе поле мiкроскопа буде освiтлене рiвномiрно і достатньо iнтенсивно. Встановлення освiтлення контролювати, дивлячись в окуляр лiвим оком.

5. На предметний столик помiстити мiкропрепарат покривним склом догори. Зрiз повинен знаходитись над отвором столика.

6. Обертаючи макрогвинт, знайти чiтке зображення структур органа або тканини на зрiзi, пiдiбрати дiлянку для вивчення, поставити її в центр поля зору мiкроскопа. Пiсля цього мiкропрепарат можна закрiпити клемами.

7. При необхiдностi переходу на велике збiльшення треба: пiдняти тубус мiкроскопа обертанням макрогвинта на себе, плавним рухом повернути револьвер i встановити об'єктив великого збiльшення (40х), почувши при цьому клацання. Далi, дивлячись збоку на мiкроскоп, обертати макрогвинт вiд себе, поки фронтальна лiнза об'єктиву максимально наблизиться до покривного скла мiкропрепарату. Пiсля цього, дивлячись в окуляр, дуже повiльно обертати макрогвинт на себе, поки не з'явиться бiльш-менш чiтке зображення. Слiд за цим перейти до повiльного обертання мiкрогвинта до появи чiткого зображення. Необхiдно пам'ятати, що необережним рухом можна розчавити мiкропрепарат.

8. У разi переходу до вивчення iншої дiлянки мiкропрепарата, слiд повернутися до малого збiльшення i повторити пп. 6 i 7.

9. Розглянути i вивчити препарат при великому збiльшеннi і приступити до його зарисовки.

10. Пiсля закiнчення роботи з мiкроскопом встановлюють об'єктив малого збiльшення.

Вивчіть електронні мікрофотографії:

Эукаріотична клітина (плазмоцит) (зб.14000) (рис. 1*).

Позначення: 1-клітинна оболонка-плазмолема, 2-цитоплазма, 3-ядро, 4-міжклітинна речовина.

Щільно розташовані клітини печінки (гепатоцити) (зб.10000) (рис. 2)

Позначення: 1-ядро, 2-цитоплазма, 3-цитолема сусідніх клітин і вузький міжклітинний простір.

Клітина круглої форми (лімфоцит) (зб.10000) (рис. 3).

Позначення: 1-ядро, 2-цитоплазма, 3-цитолема.

Келихоподібна клітина (екзокриноцит) (зб.8000) (рис. 4).

Позначення:1-ядро, 2-цитоплазма з секреторними гранулами, 3-цитолема, 4-базальний полюс, 5-апікальний полюс.

Клітина з відростками (нейроцит) (зб.8000) (рис. 5).

Позначення: 1-ядро, 2-цитоплазма, 3-цитолема, 4-відросток.

Циліндричні клітини (стовпчасті епітеліоцити) (зб.4000) (рис. 6).

Позначення:1-ядро, 2-цитоплазма, 3-цитолема, 4-ворсинки на апікальному полюсі

Без'ядерні клітини (еритроцити) (зб.5000) (рис. 7).

Позначення: 1-плазмолема, 2-гемоглобін.

Без'ядерні структури (тромбоцити) (зб.5000) (рис. 8).

Позначення: 1-плазмолема, 2-цитоплазма.

Міжклітинна речовина (пухка волокниста сполучна тканина) (зб.9000) (рис. 10).

Позначення: 1-клітина (фібробласт), 2-міжклітинна речовина: а) волокнисті структури, б) аморфний компонент.

ЛІТЕРАТУРА

1. Луцик О.Д., Іванова А.Й., Кабак К.С., Чайковський Ю.Б. Гістологія людини. Підручник.Київ „Книга-плюс”, 2003. – 592 с.

2. Волков К.С., Пасечко Н.В. Ультраструктура клітин і тканин (навчальний посібник-атлас).-Тернопіль: Укрмедкнига, 2004.-96 с.

3. Чайковський Ю.Б., Дєльцова О.І., Геращенко С.Б. Практикум з гістології, цитології та ембріолгії. Навчальний посібник. Київ-Івано-Франківськ, 2000.

4. Чайковський Ю.Б., Сокуренко Л.М. Гістологія, цитологія та ембріологія (Атлас для самостійної роботи студентів). Навчальний посібник. Луцьк: Волинська обласна друкарня, 2006.

5. Збірник тестових завдань з гістології, цитології та ембріології / Ред. Дєльцова О.І., Геращенко С.Б., Мотуляк А.П., Волошинович В.М., Попадинець О.Г., Грищук М.І., Кулинич Г.Б., Лучків Н.Ю., Бойко О.В.– Івано-Франківськ: ПП Супрун, 2011.

6. Конспект лекцій з гістології та ембріології.

* Тут і далі нумерація рисунків приведена відповідно до посібника-атласу Волков К.С., Пасечко Н.В. Ультраструктура клітин і тканин (навчальний посібник-атлас).-Тернопіль: Укрмедкнига, 2004.-96 с.