1.1.4.2.Субклеточная локализация изоцитратлиазы

Вопрос о локализации ферментов глиоксилатного цикла в настоящее время остается невыясненным, так как имеющиеся данные носят противоречивый характер. Для высших растений показано, что в жирозапасающих тканях все ферменты глиоксилатного цикла (возможно, за исключением аконитазы, локализованной в цитозоле) присутствуют, вероятно, только в глиоксисомах. Однако, недавние исследования указали на то, что оба маркерных фермента глиоксилатного цикла были найдены в митохондриальной фракции Euglena gracilis в ходе изоплотностного центрифугирования [Lowry O.H. Protein meacuament with the folin pihend reagent / O.H. Lowry, H.J. Rosebrough, A.H. Papp, B.J. Bandace // J. Biologi. – 1951. – Vol. 193. – P. 265–275.]. При протекании глиоксилатного цикла у водорослей и грибов в глиоксисомах выявляется только активность изоцитратлиазы и малатсинтазы, тогда как ферменты, общие с циклом Кребса – цитратсинтаза, аконитаза и малатдегидрогеназа – в глиоксисомах этих организмов отсутствуют [Siddiqui A. A. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round Strongyloides stercoralis / A. A. Siddiqui, C. S. Stanley, S. L. Berk // Parasite. – 2000. – Vol. 7. – P. 233–236.]. У Ascaris lumbricoides ферменты глиоксилатного цикла локализованы в определенном типе митохондрий, ответственных за протекание данного цикла. В нематоде Coenorhabditis elegans активность глиоксисомальных ферментов изоцитратлиазы и малатсинтазы обнаруживается в глиоксисомоподобных микротельцах [Jameel S.H. Caenorhabditis elegans: purification of isocitrate lyase and the isolation and cell-free translation of poly (A+) RNA./ S. H. Jameel, B. McFadden // Exp. Parasitol. – 1985. – Vol. 59. – P. 337-346.].

Более поздние исследования субклеточной локализации ферментов глиоксилатного цикла в тканях высших животных указывают на пероксисомы. Работа глиоксилатного цикла в данных органоидах подтверждается обнаружением активностей ферментов во фракции пероксисом при изоплотностном центрифугировании [Игамбердиев А.У. Микротельца в метаболизме растений / А.У. Игамбердиев. – Воронеж: Изд-во Воронеж. гос. ун-та, 1990. – 148 с.], а также данными световой микроскопии и гистохимии о заметном увеличении количества пероксисом и их тесной связи с липидными и новообразованными гликогеновыми включениями в состояниях, способствующих индукции глиоксилатного цикла [Епринцев А.Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации? / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, М.Ю. Шевченко. – М.: ИКЦ «Академкнига» , 2007. – 228 с.].

1.1.4.3. Распространение глиоксилатного цикла

1.1.4.3.1. Рапространение глиоксилатного цикла у микроорганизмов, низших растений и грибов

Глиоксилатный цикл открыт Корнбергом и Кребсом в 1957 году в клетках бактерий рода Pseudomonas [Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C₂-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature – 1957. – Vol. 179. – P. 988-991.]. Главной функцией данного метаболического пути в прокариотах является обеспечение роста, когда единственным источником углерода являются C₂-соединения, такие как этанол и ацетат.

Глюкоза не всегда доступна для микроорганизмов, которые, как правило, утилизируют простые углеродные соединения. Глиоксилатный цикл шунтирует две декарбоксилирующие реакции цикла трикарбоновых кислот и позволяет использовать C₂-соединения в качестве субстрата для глюконеогенеза[Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C₂-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature – 1957. – Vol. 179. – P. 988-991.].

Индукция ГЦ у бактерий может быть обусловлена переходом от микроаэрофильных условий культивирования к аэробным. Так у Beggiatoa leptomitiformis происходит увеличение слизистых образований бактериальной клеточной стенки из-за синтеза экзополисахаридов, способствующих снижению концентрации кислорода [Епринцев А.Т. Роль изоформ малатдегидрогеназы в регуляции анаболических процессов у бесцветных серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, М.Ю. Грабович // Микробиология. – 2004. – Т. 73, № 4. – С. 437-442.]. У бесцветной серобактерии Macromonas bipunctata пути синтеза и утилизации включений оксалатов также связаны с работой глиоксилатного цикла. При этом функционирование данного микроорганизма происходит за счет расщепления оксалоацетата и вовлечения глиоксилата в реакции ГЦ при отсутствии в питательной среде углеводов. У Macromonas bipunctata независимо от используемого соединения углерода, наряду с ЦТК, также может функционировать глиоксилатный цикл [Грабович М.Ю. Особенности углеродного метаболизма у бесцветных серобактерий Macromonas bipunctata / М.Ю. Грабович, Г.А. Дубинина, В.В. Чурикова // Микробиология. – 1993. Т. 62, вып. 3. – С. 421-429.], [Игамбердиев А.У. Внеглиоксисомальная форма изоцитратлиазы высших растений / А.У. Игамбердиев, А.А. Землянухин, И.В. Мещерякова // Физиология растений. – 1986. – Т. 33, вып. 6. С. 1113-1120.]. Кроме того, тип питания некоторых бактерий обуславливает индукцию глиоксилатного цикла, при этом трансформация метаболизма осуществляется путем ассоциации – диссоциации некоторых ферментных комплексов [Особенности структурной организации и экспрессионной регуляции изоформ МДГ из Rhodobacter sphaeroides штамма 2R / А.Т. Епринцев [и др.] // Биохимия. – 2009. – Т. 74, № 7. – С. 977-984.].

При выращивании на ацетате нефотосинтезирующей водоросли Euglena gracilis активность малатсинтазы (МС), изоцитратлиазы (ИЦЛ), малатдегидрогеназы (МДГ) и цитратсинтазы (ЦС) были обнаружены во фракции микротелец [Игамбердиев А.У. Микротельца в метаболизме растений / А.У. Игамбердиев. – Воронеж: Изд-во Воронеж. гос. ун-та, 1990. – 148 с.]. У нефотосинтезирующей Protozoa tetrahymena pyriformis изоцитратлиаза и малатсинтаза локализованы в глиоксисомоподобных структурах, однако активность других ферментов оказались связанными с митохондриальной фракцией. Таким образом, у данной водоросли глиоксилатный цикл реализуется путем кооперации ферментов микротелец и митохондрий [Игамбердиев А.У. Микротельца в метаболизме растений / А.У. Игамбердиев. – Воронеж: Изд-во Воронеж. гос. ун-та, 1990. – 148 с.].

Следует отметить, что для появления активности малатсинтазы Clorella vulgaris достаточно только переноса водоросли в темноту, в то время как для появления активности изоцитратлиазы также необходимо присутствие ацетата.

В эвглене при переносе на ацетат в отсутствие света развиваются глиоксисомоподобные структуры, содержащие не только малатсинтазу и изоцитратлиазу, но и цитратсинтазу и малатдегидрогеназу.

Активность глиоксилатного цикла впервые была показана у грибов в лаборатории Корнберга у дрожжей Saccaromyces cerevisiae, и индукция ее зависит от источника углеродного питания. МС и ИЦЛ локализованы по данным одних авторов в цитозоле, но по другим данным эти ферменты локализованы в глиоксисомоподобных органеллах. Ключевые ферменты глиоксилатного цикла обнаружились также в микротельцах у грибов родов Candida, Neurospora, в различных оо-, аско-, зиго-и базидиомицетах. Общим для ферментов из этих источников является индукция при росте на C₂-соединениях и локализация в клеточных структурах, сходных с микротельцами.

При росте грибов на среде, содержащей сахара, синтез изоцитратлиазы и малатсинтазы подавляется, в то время как при отсутствии глюкозы в среде и наличии ацетата в качестве единственного углеродного источника активность этих ключевых ферментов глиоксилатного цикла достигла максимального уровня.

Практически у всех изученных грибов функционирование глиоксилатного цикла характерно для прорастающих аскоспор нейроспоры, что связано с утилизацией запасных жиров [Schaik van E. J. Burkholderia pseudomallei Isocitrate Lyase Is a Persistence Factor in Pulmonary Melioidosis: Implications for the Development of Isocitrate Lyase Inhibitors as Novel Antimicrobials/ E. J. van Schaik, M. Tom, D. E. Woods // Infection and Immunity – 2009 – Vol. 77, №10 – P. 4275–4283.].

Новый импульс исследования ГЦ получили после открытия его вклада в патогенез возбудителей инфекционных заболеваний [Schaik van E. J. Burkholderia pseudomallei Isocitrate Lyase Is a Persistence Factor in Pulmonary Melioidosis: Implications for the Development of Isocitrate Lyase Inhibitors as Novel Antimicrobials/ E. J. van Schaik, M. Tom, D. E. Woods // Infection and Immunity – 2009 – Vol. 77, №10 – P. 4275–4283.]. Было показано, что необходимым условием патогенности возбудителей некоторых заболеваний растений, животных и человека является функционирование ГЦ. Активация глиоксилатного цикла в патогенных клетках дает преимущество болезнетворным микроорганизмам при нахождении внутри фагоцитов, обеспечивающих клеточный иммунитет [Insights into corn genes derived from large-scale cDNA Sequencing / N.N. Alexandrov [et. al.] // Plant Mol Biol. – 2009. – Vol. 69. – P. 179-194.], [Canovas D. Developmental regulation of the glyoxylate cycle in the human pathogen Penicillium marneffei / D. Canovas, A. Andrianopoulos // Mol Microbiol. – 2006. – Vol. 62, № 6. – P. 1725-1738.], [Isocitrate lyase from Mycobacterium tuberculosis promotes survival of Mycobacterium smegmatis within macrophage by suppressing cell apoptosis / J.M. Li [et. al.] // Chin Med J (Engl). – 2008. – Vol. 121, № 12. – P. 1114-1123.].

В недавних публикациях сообщается о том, что ферменты ГЦ также необходимы для вирулентности патогенов растений. Штамм бактерии Rhodococcus fascians (возбудитель галла некоторых растений), дефектный по гену МС, мог существовать в растительных тканях, однако не был способен вызывать заболевание [Isocitrate lyase activity is required for virulence of the intracellular pathogen Rhodococcus equi / D.M. Wall [et. al.] // Infect. Immun. – 2005. – Vol. 73, № 10. – P. 6736-6741.]. Аналогично мутантные по гену ИЦЛ штаммы фитопатогенного гриба Leptosphaeria maculans, поражающего капусту (Brassica napus), были вирулентны [Idnurm A. Isocitrate lyase is essential for pathogenicity of the fungus Leptosphaeria maculans to canola (Brassica napus) / A. Idnurm, B.J. Howlett // Eukaryot. Cell. – 2002. – Vol. 1. – P. 719-724.].

Анализ с помощью биочипов показал, что ГЦ индуцируется в ответ на инфекцию в тканях растения Arabidopsis thaliana [Murray C.J. Modeling the impact of global tuberculosis control strategies / C.J. Murray, J.A. Salomon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – Vol. 95, № 13. – P. 881-886.]. Предполагается, что смысл работы ГЦ в растении в ответ на инфекцию сводится к ускоренному использованию запасных липидов как косвенной защите от проникших в организм патогенов [дисер].