- •Глава 1. Обзор литературы
- •Глава 2. Экспериментальная часть
- •Глава 1. Обзор литературы
- •1.1. Функциональная характеристика изоцитратлиазы и ее роль в регуляции клеточного метаболизма
- •1.1.1. Общая характеристика глюконеогенеза
- •1.1.2. Глюконеогенез в растениях
- •1.1.3. Глюконеогенез у животных
- •1.1.4. Глиоксилатный цикл
- •1.1.4.1. Роль глиоксилатного цикла в глюконеогенезе
- •1.1.4.2.Субклеточная локализация изоцитратлиазы
- •1.1.4.3. Распространение глиоксилатного цикла
- •1.1.4.3.1. Рапространение глиоксилатного цикла у микроорганизмов, низших растений и грибов
- •1.1.4.3.2. Функционирование глиоксилатного цикла у высших растений
- •1.1.4.3.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных
- •1.1.5. Изоферментный состав изоцитратлиазы
- •1.2. Молекулярные аспекты регуляции ицл
- •1.2.1. Экспрессионная регуляция изоцитратлиазы
- •1.2.2. Генетические механизмы регуляции синтеза ицл
- •1.2.3. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы
- •1.2.4. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла
- •1.3. Особенности метаболизма нетрадиционной культуры амаранта
- •1.3.1. Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта
- •1.3.2. Химический состав амаранта
- •Глава 2. Экспериментальная часть
- •2.1. Цель и задачи
- •2.2.2.2. Определение количества белка
- •2.2.2.3. Электрофоретические исследования белков
- •2.2.2.4. Специфическое проявление изоцитратлиазы
- •2.2.2.5. Исследование субклеточной локализации
- •2.2.2.6. Выделение суммарной клеточной популяции рнк
- •2.2.2.7. Проведение обратной транскрипции
- •2.2.2.8. Подбор праймеров
- •2.2.2.9. Проведение полимеразной цепной реакции
- •2.2.2.10. Секвенирование пцр-продукта
- •2.2.2.11. Проведение пцр в реальном времени
- •2.2.2.12. Статистическая обработка данных
- •2.3. Результаты исследования и их обсуждение
- •2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы из проростков амаранта
- •2.3.2. Изоферментный состав ицл в проростках амаранта
- •2.3.3. Исследование субклеточной локализации ицл
- •2.3.4. Идентификация генов изоцитратлиазы
- •2.3.4.1. Выделение суммарной клеточной популяции рнк
- •2.3.4.2. Проведение обратной транскрипции
- •2.3.4.3. Проведение полимеразной цепной реакции
- •2.3.4.4. Определение нуклеотидной последовательности продуктов полученных методом пцр
- •2.3.4.5. Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках амаранта
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1. Цель и задачи
Целью работы являлось идентификация генов изоцитратлиазы и анализ их экспрессии в проростках семян амаранта сорта «Рыжик».
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить динамику активности изоцитратлиазы в проростках семян амаранта сорта «Рыжик»;
Определить изоферментный состав ИЦЛ;
Исследовать субклеточную локализацию изоцитратлиазы;
Провести ОТ-ПЦР анализ кДНК из проростков амаранта для идентификации генов, кодирующих ИЦЛ;
Секвенировать участки генов изоцитратлиазы из объекта исследования;
Исследовать экспрессию генов изоцитратлиазы.
2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Объект исследования
Объектом исследования данной экспериментальной работы являются прорастающие семена амаранта (Amaranthus caudatus L., сорт «Рыжик»), выращенные гидропонным способом при температуре 25°С.
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Определение активности изоцитратлиазы
Активность ИЦЛ (К.Ф. 4.1.3.1) определяли спектрофотометрическим методом на СФ-2000. Спектрофотометрирование проводили в среде калориметрирования с добавлением 20 мкл гомогената. Среда спектрофотометрирования для изоцитратлиазы: 50 ммоль/л Tris HCl буфер, рН 7,5; 5 мМ изоцитрат натрия; 5 мМ MgCl2; 4 ммоль/л фенилгидразин солянокислый. Данный метод основан на образовании комплекса фенилгидразина с глиоксилатом, поглощающим при 324 нм [Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature – 1957. – Vol. 179. – P. 988-991.].
За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата за одну минуту при 25оС и оптимальном значении рН.
2.2.2.2. Определение количества белка
Определение общего количества белка проводили по методу Лоури [Lowry O.H. Protein meacuament with the folin pihend reagent / O.H. Lowry, H.J. Rosebrough, A.H. Papp, B.J. Bandace // J. Biologi. – 1951. – Vol. 193. – P. 265–275.]. Метод основан на образовании комплексного окрашенного соединения в результате взаимодействия белка со щелочным раствором сульфата меди (биуретовая реакция) и вольфраматом и молибдатом натрия (реакция Фолина на тирозиновые и цистеиновые радикалы). Количество белка рассчитывали по формуле:
А = 0,37 ∙ D ∙ V1 / V2,
где D – оптическая плотность при 750 нм;
V1 – объём фракции или общий объём гомогената, мл;
V2 – объем внесения, мл;
0,37 – коэффициент поглощения раствора Фолина.
Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре СФ-2000 (Россия) при 750 нм.
2.2.2.3. Электрофоретические исследования белков
Электрофоретическое исследование проводили по методу Девиса [Davis B.J. Disc electrophoresis II. Method and aplication to human serum protein / B.J. Davis // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1994. – Vol. 121. – P. 404–427.]. Для концентрирования белкового раствора готовили крупнопористый 4% полиакриламидный гель. Концентрирующий гель содержал Tris-HCl рН 6,7, ТЕМЕД, акриламидную смесь (10% АСА / 2,5% МВА). Разделение осуществляли на разделяющем (мелкопористом) 8% полиакриламидном геле (содержал Tris-HCl, рН 8,3, ТЕМЕД, акриламидную смесь (30% АСА/ 0,8% МВА), персульфат аммония). После окончания процесса полимеризации наносили исследуемые пробы. На один карман пластинки наносили не более 3-5 мкг белка исследуемого образца. Электродный буфер представлял собой смесь 0,5 М Трис-глицеринового буфера рН 8,3.
Для контроля движения фронта в пробу вносили 0,1% раствор бромфенолового синего. Электрофорез ферментативных препаратов проводили при постоянном токе силой 2,0 мА из расчета на одну пробу, а затем силу тока увеличивали до 4-5 мА.